β氧化作用的提出是在二十世紀初，Franz Knoop 在此方面作出了關鍵性的貢獻。他將末端甲基上連有苯環的脂肪酸喂飼狗，然后檢測狗尿中的產物。結果發現，食用含偶數碳的脂肪酸的狗的尿中有苯乙酸的衍生物苯乙尿酸，而食用含奇數碳的脂肪酸的狗的尿中有苯甲酸的衍生物馬尿酸。 Knoop由此推測無論脂肪酸鏈的長短，脂肪酸的降解總是每次水解下兩個碳原子。據此，Knoop 提出脂肪酸的氧化發生在β-碳原子上，而后Ca與Cb之間的鍵發生斷裂，從而產生二碳單位，此二碳單位Knoop推測是乙酸。
以后的實驗證明Knoop推測的準確性，由此提出了脂肪酸的β-氧化作用。
β-氧化作用是指脂肪酸在β-碳原子上進行氧化，然后α-碳原子和β-碳原子之間鍵發生斷裂。每進行一次β-氧化作用，分解出一個二碳片段，生成較原來少兩個碳原子的脂肪酸。
后來對CoA的發現以及分離和提純了參與脂肪酸氧化的各種酶，更弄清了其氧化機制的細節。E．P．Kennedy 和 A．L．Lehninger（1949）指出此氧化系統存在于線粒體中，后來D．E．Green及F．Lynen（1953）各自獨立地從線粒體的丙酮粉末提取出可溶性酶，成功地分離出β氧化各個階段的酶，明確了脂肪β氧化，按下述過程進行：
（1）由脂肪酸活化酶使脂肪酸與 CoA結合，
（2）由乙酰CoA脫氫酶的作用使乙酰CoA脫氫，
（3）由烯酰CoA水合酶的作用使烯酰CoA加水，
（4）由β-羥基乙酰 CoA脫氫酶的作用使β-羥基乙酰 CoA脫氫，
（5）由β-酮酰CoA硫解酶的作用使β酮酰CoA裂解。
經以上5個階段逐次游離出來的乙酰CoA（C2片段）經三羧酸循環而氧化。其能量收支為每分子棕櫚酸（C16）產生130分子ATP。不飽和脂肪酸的氧化除需上述各種酶之外，還需要催化3-順-烯酰CoA轉變成2-反式的3-順， 2-反-烯酰CoA異構酶和催化D（一）-3-羥式成L（+）-3-羥式的3-羥乙酰CoA－3-表異構酶參與。由奇數C原子脂肪酸分解產生的丙酰CoA，通過羧化及異構化而轉變成琥珀酰CoA再進一步變化。