λ噬菌體DNA限制性內切酶圖譜分析

λDNA是線狀雙鏈DNA,EcoRⅠ在其上有5個切點,產生6個片段,通過瓊脂糖凝膠電泳可將這幾條片段分離開。如何重建這6個片段呢?可用兩種限制性內切酶同時或先后作用于λDNA。例如λDNA經EcoRⅠ切割后在凝膠上分離開來的6條帶可洗脫出來,然后分別將這6條片段用HindⅢ切割。結果表明片段1上沒有HindⅢ酶切點,而片段2上有2個HindⅢ切點,完整線狀λDNA上有6個HindⅡ酶切點產生7條片段。根據片段大小和酶切點之間關系可作出初步的限制性內切酶圖譜。將限制性內切酶圖譜轉化為基因排列圖,最常用的方法是Southernblot,即將電泳后的酶切片段與特殊基因DNA或其RNA探針雜交,從而將此基因定位于一定的酶切片段上。

λ噬菌體DNA

λDNA EcoRⅠ標準品λDNA HindⅢ標準品λDNA(EcoRⅠ+HindⅢ)標準品限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ限制性內切酶反應10×緩沖液瓊脂糖凝膠電泳緩沖液瓊脂糖凝膠中回收DNA系統

恒溫水浴鍋振蕩器瓊脂糖凝膠電泳裝置進樣槍離心機凝 膠電泳成像系統微量移液器及吸頭Eppendorf 管

(一)λDNA-EcoRⅠ酶解反應

1.取一無菌新Eppendorf管依次加入16μL無菌去離子水、2μL 10×EcoRⅠ緩沖液、1μL EcoRⅠ酶,最后加入λDNA1μL(總反應體積為20μL),此為小量酶解反應體系,主要用于酶切鑒定。如需制備基因片段,可選用大量酶解反應體系,反應體積為50～100μL,相應擴大各種試劑的加入量。

2.輕輕地將Eppendorf管中反應試劑混合均勻,置37℃水浴保溫1～1.5h后終止反應(根據不同酶說明書的要求)。

3.取出樣品進行適當濃度的瓊脂糖凝膠電泳(考慮到要從凝膠中回收DNA,可選用低熔點瓊脂糖制膠)。

(二)從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段

1.在長波紫外燈下小心切下含有待回收DNA片段的凝膠裝入Eppendorf管中。

2.將Eppendorf管中凝膠輕輕弄碎,加入2～5倍體積的TE緩沖液,置65℃保溫10min,取出冷卻至室溫。

3.取出回收管,加入等體積的飽和酚充分混勻后經4000×g離心10min。

4.取水相于另一Eppendorf管中,再用等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)混合物提取一次。

5.經4000×g離心10min后將上清液轉入另一新Eppendorf管中,加入0.2倍體積的10moL/L乙酸銨和2倍體積的冷乙醇,混勻后室溫靜置10min。

6.經12000×g,4℃離心20min。棄上清液,用70%乙醇淋洗兩次;將DNA樣品置于65℃烘5～10min至干燥,加入適量的TE緩沖液或無菌去離子水溶解DNA。

7.取少量溶解的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳,檢測回收DNA的純度與濃度。

8.同樣方法回收其他5個DNA片段。

(三)λDNA-HindⅢ酶解反應

1.取一無菌新Eppendorf管,依次加入13～15μL雙蒸水、2μL 10×HindⅢ緩沖液、1μLHindⅢ酶,最后加入λDNA-EcoRⅠ酶解后回收的一個片段DNA10μL。同樣取5只Eppendorf管,做成其他5個片段的HindⅢ酶反應系統。

2.將酶切反應系統輕輕混勻后,置于37℃水浴保溫1～1.5h后終止反應。

3.取適量樣品用于瓊脂糖凝膠電泳分析。同時用λDNA/EcoRⅠ標準品、λDNA/HindⅢ標準品、λDNA/(EcoRⅠ+HindⅢ)標準品對照。

(四)λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ雙酶解反應

雙酶解反應在兩個酶反應條件相同或相近時,可參照小量酶解反應進行。當反應條件不同,例如緩沖液NaCL濃度要求相差太遠時,酶活性受到抑制,需分別進行酶解反應,可從低鹽到高鹽的次序進行。先用低鹽緩沖液進行相應的酶解反應,再補加NaCL,同時將反應體積擴大至30μL。如果不用這種方法,可采用乙醇沉淀法,將已被一種酶降解的DNA沉淀后,重新建立反應體系。每種限制性內切酶都有其最佳反應條件,一般來說,標定酶單位的條件就是反應的標準條件。各限制性內切酶產品往往對同一種酶也推薦使用不同的反應條件,因此建議按照產品說明書進行操作。本實驗采用乙醇沉淀法,先沉淀被一種酶酶解的DNA,然后重建反應體系。

1.取一無菌新Eppendorf管,依次加入16μL無菌去離子水、2μL10×EcoRⅠ緩沖液、1μLEcoRⅠ酶,最后加入λDNA1μL,輕輕混合均勻。

2.將樣品液置于37℃水浴保溫1～1.5h后終止反應。

3.用乙醇沉淀法將已被一種酶酶解的DNA沉淀。

4.加入無菌去離子水17μL,使沉淀干燥后的DNA溶解。

5.在DNA樣品液依次加入2μL10×HindⅢ緩沖液和1μLHindⅢ酶。

6.輕輕混勻后,置37℃水浴保溫1～1.5h后終止反應。

7.取適量的酶切樣品進行瓊脂糖凝膠電泳。同時用λDNA/EcoRⅠ標準品、λDNA/HindⅢ標準品、λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ標準品作為對照。

1.操作步驟中提出的DNA和酶的加入量可依不同產品批次進行調整,反應總體積不變。

2.一般最后加入DNA樣品,以免操作不當引起試劑污染。

3.用微量進樣器加樣時每次要更換槍頭(除先加水外),避免交叉污染。

4.當樣品加入反應管后要將Eppendorf管蓋上,以免保溫時水蒸氣進入管內。