?免疫組織化學法實驗——懸浮細胞的免疫熒光標記

細胞生長于含培養液的15 mL Falcon管中

PBSPFA固定液

多聚L-賴氨酸包被的載玻片

1) 細胞在冰浴中冷卻，然后用臺式離心機在4℃以800 g離心5 min (用于淋巴細胞）。吸去培養液并以4℃的PBS重懸細胞。

離心機轉速依細胞類型進行調整，但必須低轉速離心，以防止損傷細胞。除非特別說明，否則所有離心步驟均在此條件下進行。

2) 離心，吸去PBS，以1?2 mL 2% PFA固定液，或2% PFA固定液/0. 1% Triton ×- 100重懸細胞，置冰上固定30 min。

3) 離心、吸去固定液，用15 mL 4℃的PBS重懸細胞，放置5 min,再用PBS進行第二次洗滌。使用大體積緩沖液可以減少洗滌次數。

4) 第一抗體在4℃用微量離心機以13500 g離心2 min。250μL抗體足夠用于5×10⁶ 細胞。

5) 離心細胞，吸去PBS，重懸細胞于第一抗體中，置4℃溫育1 h。

6) 用4℃的PBS稀釋細胞和抗體至15 mL。

7) 離心，吸去PBS，以4℃的PBS重懸細胞，重復1次。

8) 第二抗體4℃用微量離心機以13500 g離心2 min。5×10⁶細胞用250μL抗體就 足夠。

9) 吸去PBS，以第二抗體重懸細胞，4℃溫育lh。重復步驟6及步驟7。

10) 除非立即觀察細胞，否則在進行細胞最后濃縮的下一步操作之前應以鋁箔包裹離心 管并冷藏。

11) 離心細胞并以少量PBS重懸（勿用水），將細胞懸液滴于多聚L-賴氨酸覆層的載玻片上，加上蓋玻片，盡可能馬上觀察結果。