本通則適用于人用生物制品生產用動物細胞基質及檢定用動物細胞,包括具有細胞庫體系的細胞及原代細胞。細胞基質系指可用于生物制品生產的所有動物或人源的連續傳代細胞系、二倍體細胞株及原代細胞。
生產非重組制品所用的細胞基質,系指來源于未經修飾的用于制備其主細胞庫的細胞系/株和原代細胞。生產重組制品的細胞基質,系指含所需序列的、從單個前體細胞克隆的轉染細胞。生產雜交瘤制品的細胞基質,系指通過親本骨髓瘤細胞系與另一親本細胞融合的雜交瘤細胞系。
一、對生產用細胞基質總的要求
用于生物制品生產的細胞系/株均須通過全面檢定,須具有如下相應資料,并經國家藥品監督管理部門批準。
(一)細胞系/株歷史資料
1. 細胞系/株來源資料
應具有細胞系/株來源的相關資料,如細胞系/株制備機構的名稱,細胞系/株來源的種屬、年齡、性別和健康狀況的資料。這些資料最好從細胞來源實驗室獲得,也可引用正式發表文獻。
人源細胞系/株須具有細胞系/株的組織或器官來源、種族及地域來源、年齡、性別、健康狀況及病原體檢測結果的相關資料。
動物來源的細胞系/株須具有動物種屬、種系、飼養條件、組織或器官來源、地域來源、年齡、性別、供體的一般健康狀況及病原體檢測結果的相關資料。
如采用已建株的細胞系/株,應具有細胞來源的證明資料。應從能夠提供初始細胞歷史及其溯源性書面證明材料的機構獲得,且應提供該細胞在該機構的詳細傳代記錄,包括培養過程中使用的所有原材料的詳細信息,如種類、來源、批號、生產日期及有效期、制備或使用方法、質量標準及檢測結果等。
2. 細胞系/株培養歷史的資料
應具有細胞分離方法、細胞體外培養過程及細胞系/株建立過程的相關資料,包括所使用的物理、化學或生物學手段,外源插入序列,篩選細胞所進行的任何遺傳操作或篩選方法、在動物體內傳代過程以及細胞生長特征、培養液成分等;同時還應具有細胞鑒別、內源及外源因子檢查結果的相關資料。
應提供細胞傳代歷史過程中所用的細胞培養液的詳細成分并應具有溯源性,如使用人或動物源性成分,如血清、胰蛋白酶、乳蛋白水解物或其他生物學活性的物質,應具有這些成分的來源、批號、制備方法、質量控制、檢測結果和質量保證的相關資料。
(二)細胞培養操作要求
細胞取材、建庫及制備全過程應具有可溯源性及操作的一致性,并對各個環節的風險進行充分的評估。
1. 細胞來源供體
所有類型細胞的供體應無傳染性疾病或未知病原體的疾病。神經系統來源的細胞不得用于疫苗生產。
2. 原材料的選擇
與細胞培養相關的所有材料,特別是人源或動物源性材料,應按照本版藥典的相關要求進行風險評估,選擇與生產相適應的原材料,必要時進行檢測。所有生物源性材料均應無細菌、真菌、分枝桿菌、支原體及病毒等外源因子污染。細胞培養過程中所用的牛血清及胰酶應符合本版藥典的相關要求。
細胞培養液中不得含有人血清。如果使用人血白蛋白,應使用獲得國家藥品監督管理部門批準的人用藥品。
細胞制備過程中不得使用青霉素或β-內酰胺(β-Lactam)類抗生素。配制各種溶液的化學藥品應符合本版藥典(四部)或其他相關國家標準的要求。
3. 細胞培養體系
應控制對細胞生長有重大影響的、關鍵的已知可變因素,包括規定細胞培養液及其添加成分的化學組成及純度;所有培養用試劑應有制備記錄并經檢定合格后使用,應規定細胞培養的理化參數(如pH值、溫度、濕度、氣體組成等)的變化范圍并進行監測,以保證細胞培養條件的穩定性。
4. 細胞收獲及傳代
應結合生產工藝的特性,盡可能減少對細胞的操作。細胞收獲及傳代應采用可重復的方式,以保證收獲時細胞的匯合率、孵育時間、溫度、離心速度、離心時間以及傳代后活細胞接種密度具有一致性。
傳代細胞的體外細胞齡可采用細胞群體倍增水平或傳代水平計算。
二倍體細胞的細胞齡通常以群體倍增水平計算,也可以每個培養容器細胞群體細胞數為基礎,每增加1倍作為1世代粗略估算,即 1 瓶細胞傳 2 瓶(1 : 2 分種率),再長滿瓶為 1 世代;1 瓶細胞傳 4 瓶(1 : 4 分種率)為 2 世代;1 瓶細胞傳 8 瓶(1 : 8 分種率)則為 3 世代。生產用細胞齡限制在細胞壽命期限的前 2/3 內。
連續傳代細胞系的細胞齡可以群體倍增水平計算,也可以按照固定的傳代比率進行傳代,每傳代 1 次視為 1 代。
5. 細胞系建立
細胞系建立過程中進行了對細胞特性有重要影響的操作,如導致細胞具有了成瘤性,或經細胞克隆及遺傳修飾等操作的細胞,應被視為一個新的(或不同的)細胞系,應在原細胞名稱后增加后綴或編號重新命名,并重新建立主細胞庫。
在細胞克隆過程中,應選擇單個細胞用于擴增,詳細記錄克隆過程,并根據整合的重組 DNA 的穩定性、細胞基因組及表型的穩定性、生長速率、目的產物表達水平和完整性及穩定性,篩選具有分泌目的蛋白最佳特性的候選克隆,用于建立細胞種子。
6. 細胞凍存
應在大多數細胞處于對數生長期時進行細胞凍存。應采用符合細胞培養物的最佳凍存方法;每一次凍存時均應采用相同的降溫過程,并記錄凍存過程。
每一個細胞庫凍存時,應將同一次擴增的處于相同倍增水平的細胞培養物合并,混勻后分裝。每支凍存管中的細胞數應足以保證細胞復蘇后可獲得有代表性的培養物。
對于一個新的細胞庫,除早代培養物在組織采集時或重組細胞篩選時可能需要使用抗生素外,細胞建庫培養時不應使用抗生素。
7. 生產人員
生產人員應定期檢查身體,已知患有傳染性疾病的人員不能進行細胞培養的操作。在生產區內不得進行非生產制品用細胞或微生物的操作;在同一工作日進行細胞培養前,不得接觸動物或操作有感染性的微生物。
(三)細胞庫
細胞庫的建立可為生物制品的生產提供檢定合格、質量相同、能持續穩定傳代的細胞。
細胞建庫應在符合中國現行《藥品生產質量管理規范》的條件下制備。
1. 細胞庫的建立
三級細胞庫管理包括細胞種子、主細胞庫(MCB)及工作細胞庫(WCB)的管理。在某些特殊情況下,也可采用細胞種子及 MCB 二級管理,但須得到國家藥品監督管理部門的批準。
(1)細胞種子(Cell Seed)
由一個原始細胞群體發展成傳代穩定的細胞群體,或經過克隆培養而形成的均一細胞群體,通過檢定證明適用于生物制品生產或檢定。在特定條件下,將一定數量、成分均一的細胞懸液,定量均勻分裝于一定數量的安瓿或適宜的細胞凍存管,于液氮或 -130℃ 以下凍存,即為細胞種子,供建立主細胞庫用。
對于引進細胞,生產者獲得細胞后,凍存少量細胞,經過驗證可用于生物制品生產,此細胞可作為細胞種子,供建立主細胞庫用。
(2)主細胞庫(MCB)
取細胞種子通過規定的方式進行傳代、增殖后,在特定倍增水平或傳代水平同次均勻地混合成一批,定量分裝于一定數量的安瓿或適宜的細胞凍存管,保存于液氮或 -130℃ 以下,經全面檢定合格后,即可作為主細胞庫,用于工作細胞庫的制備。生產企業的主細胞庫最多不得超過兩個細胞代次。
(3)工作細胞庫(WCB)
工作細胞庫的細胞由 MCB 細胞傳代擴增制成。由 MCB 的細胞經傳代增殖,達到一定代次水平的細胞,合并后制成一批均質細胞懸液,定量分裝于一定數量的安瓿或適宜的細胞凍存管中,保存于液氮或-130℃以下備用,即為工作細胞庫。生產企業的工作細胞庫必須限定為一個細胞代次。凍存時細胞的傳代水平須確保細胞復蘇后傳代增殖的細胞數量能滿足生產一批或一個亞批制品。復蘇后細胞的傳代水平應不超過批準用于生產的最高限定代次。所制備的 WCB 必須經檢定合格[見本通則“一、(四)細胞檢定”中有關規定]后,方可用于生產。
2. 細胞庫的管理
主細胞庫和工作細胞庫應分別存放。每一個庫應在生產設施內至少 2 個不同的地點或區域存放。應監測并維護細胞庫凍存容器,以保證細胞庫貯存在一個高度穩定的環境中。
非生產用細胞應與生產用細胞嚴格分開存放。
每種細胞庫均應分別建立臺賬,詳細記錄放置位置、容器編號、分裝及凍存數量、取用情況等。細胞庫中的每支細胞均應具有細胞系/株名、代次、批號、編號、凍存日期、貯存容器的編號等信息。
為保證細胞凍存后仍具有良好的活力,凍存前的細胞活力應不低于 90%,凍存后應取一定量的可代表凍存全過程的凍存管復蘇細胞,復蘇后細胞的活力應不低于 80%。二倍體細胞凍存后,應至少做一次復蘇培養并連續傳代至衰老期,檢查不同傳代水平的細胞生長情況。細胞凍存后,可通過定期復蘇細胞及復蘇后細胞的活力數據驗證細胞在凍存及貯存條件下的穩定性。
(四)細胞檢定
細胞檢定主要包括以下幾個方面:細胞鑒別、外源因子和內源因子的檢查、成瘤性/致瘤性檢查等。必要時還須進行細胞生長特性、細胞染色體檢查,細胞均一性及穩定性檢查。這些檢測內容對于 MCB 細胞和 WCB 細胞及生產限定代次細胞均適用。
細胞檢定項目的基本要求見表1。細胞庫建立后應至少對 MCB 細胞及生產終末細胞(EOPC)進行一次全面檢定。當生產工藝發生改變時,應重新對 EOPC 進行檢測。每次從 MCB 建立一個新的 WCB,均應按規定項目進行檢定。
注:①表示生產終末細胞,是指在或超過生產末期時收獲的細胞,盡可能取按生產規模制備的生產末期細胞。
“+"為必檢項目,“-"為非強制檢定項目。
(+)表示需要根據細胞特性、傳代歷史、培養過程等情況要求的檢定項目。
*表示 MCB 或 WCB。
1. 細胞鑒別試驗
新建細胞系/株、細胞庫( MCB 和 WCB)和生產終末細胞應進行鑒別試驗,以確認為本細胞,且無其他細胞的交叉污染。細胞鑒別試驗方法有多種,包括細胞形態、生物化學法(如同工酶試驗)、免疫學檢測(如組織相容性抗原、種特異性免疫血清)、細胞遺傳學檢測(如染色體核型、標記染色體檢測)、遺傳標志檢測[如 DNA指紋圖譜,包括短串聯重復序列(STR)、限制片段長度多態性(RFLP-PCR)和內含子多態性(EPIC-PCR)法等]以及其他方法(如雜交法、PCR法、報告基因法等)。應至少選擇上述一種或幾種方法對細胞進行種屬和細胞株間及專屬特性的鑒別。
2. 細菌、真菌無菌檢查
取混合細胞培養上清液或凍存細胞管樣品,依法檢查(通則 1101),應符合規定。對于 MCB 及 WCB 培養物,至少取混合細胞培養上清液 10ml,盡可能采用薄膜過濾法檢測。對于凍存細胞,至少取凍存細胞總支數的 1% 或至少 2 支凍存細胞管(取量大者),可采用直接接種法檢測。
3. 分枝桿菌檢查
取至少 107 個活細胞用培養上清液制備細胞裂解物,按照無菌檢查法(通則1101)進行分枝桿菌檢查。
取細胞裂解物接種于適宜的固體培養基(如羅氏培養基或 Middlebrook 7H10 培養基),每個培養基接種 1ml 并做 3 個重復,并同時以不高于 100CFU 的草分枝桿菌菌液作為陽性對照。將接種后的培養基置于 37℃ 培養 56 天,陽性對照應有菌生長,接種供試品的培養基未見分枝桿菌生長,則判為合格。
用于外源病毒因子檢查的豚鼠接種法也可檢測分枝桿菌,按表2所列方法進行試驗和觀察。豚鼠在注射前應觀察4周,結核菌素試驗為陰性者方可用于試驗,觀察期末應進行結核菌素試驗,并剖檢觀察主要臟器是否有結節形成。結核菌素試驗為陰性,主要臟器無結節,則為符合要求。
也可采用經過驗證的分枝桿菌核酸檢測法替代培養法。
4. 支原體檢查
取細胞培養上清液樣品,依法檢查(通則 3301),應符合規定。
5. 細胞內、外源病毒因子檢查
應注意檢查細胞系/株中是否有來源物種中潛在的可傳染的病毒,以及由于使用的原材料或操作帶入的外源性病毒。細胞進行病毒檢查的種類及方法,須根據細胞的種屬來源、組織來源、細胞特性、傳代歷史、培養方法及過程等確定。如 MCB 進行了全面檢定,WCB 需檢測的外源病毒種類可主要考慮從 MCB 到 WCB 傳代過程中可能引入的病毒,而僅存在于MCB建庫前的病毒可不再重復檢測。
(1)細胞形態觀察及血吸附試驗
取混合瓶細胞樣品,接種至少 6 個細胞培養瓶或培養皿,待細胞長成單層或至一定數量后換維持液,持續培養兩周。如有必要,可以適當換液。逐日鏡檢細胞,細胞應保持正常形態特征。
如為貼壁細胞或半貼壁細胞,細胞至少培養 14 天后,分別取 1/3 細胞培養瓶或培養皿,用 0.2%~0.5% 豚鼠紅細胞和雞紅細胞混合懸液進行血吸附試驗。一半加入紅細胞后置 2~8℃ 作用 30 分鐘,一半置 20~25℃ 作用 30 分鐘,分別進行鏡檢,觀察紅細胞吸附情況,結果應為陰性。
新鮮紅細胞在 2~8℃ 保存不得超過 7 天,且溶液中不應含有鈣或鎂離子。
(2)體外不同指示細胞接種培養法檢測病毒因子
用待檢細胞培養上清液制備活細胞或細胞裂解物,分別接種至少下列三種單層指示細胞,包括猴源細胞、人二倍體細胞和同種屬、同組織類型來源的細胞。待測樣本檢測前,可于 -70℃ 或以下保存。
每種單層指示細胞至少接種 107 個活細胞或相當于 107 個活細胞的裂解物。接種量應占維持液的 1/4 以上,每種指示細胞至少接種 2 瓶。取培養 7 天的細胞各 1 瓶,取上清液或細胞裂解物再分別接種于新鮮制備的相應的指示細胞盲傳一代,與初次接種的另一瓶細胞繼續培養 7 天,觀察細胞病變,并在觀察期末取細胞培養物進行血吸附試驗;取細胞培養上清液進行紅細胞凝集試驗。
用 0.2%~0.5% 豚鼠紅細胞和雞紅細胞混合懸液進行血吸附試驗和紅細胞凝集試驗。將混合紅細胞加入細胞培養瓶,一半置于 2~8℃ 孵育 30 分鐘,一半置于 20~25℃ 孵育 30 分鐘,分別進行鏡檢,觀察紅細胞吸附情況。取細胞上清液從原倍起進行倍比稀釋后,加入混合紅細胞,先置 2~8℃ 孵育 30 分鐘,然后置于 20~25℃ 孵育 30 分鐘,分別觀察紅細胞凝集情況。
接種的每種指示細胞不得出現細胞病變,血吸附試驗及紅細胞凝集試驗均應為陰性。試驗應設立病毒陽性對照,包括可觀察細胞病變的病毒陽性對照、血吸附陽性對照及血凝陽性對照。如待檢細胞裂解物對單層細胞有干擾,則應排除干擾因素。
若已知待檢細胞可支持人或猴巨細胞病毒(CMV)的生長,則應在接種人二倍體細胞后至少觀察 28 天,應無細胞病變,且血吸附試驗及紅細胞凝集試驗均應為陰性。
(3)動物體內接種法檢測外源病毒因子
用待檢細胞培養上清液制備活細胞(或適宜時采用相當量的細胞裂解物),接種動物體內進行外源病毒因子檢測。待檢細胞至少應接種乳鼠、成年小鼠和雞胚(兩組不同日齡)共計 4 組,如為新建細胞,還需接種豚鼠。原代猴腎細胞還需用家兔體內接種法或兔腎細胞培養法檢查猴皰疹 B 病毒。按表 2 所列方法進行試驗和觀察。接種后 24 小時內動物死亡超過 20%,試驗無效。
觀察期內,如被接種動物出現異常或疾病應進行原因分析,觀察期內死亡的動物應進行大體解剖觀察及組織學檢查,以確定死亡原因。如動物顯示有病毒感染,則應采用培養法或分子生物學方法對病毒進行鑒定(如觀察期內超過 20% 的動物出現死亡,且可明確判定為因動物撕咬所致),試驗判定為無效,應重試。
觀察期末時,符合下列條件判為合格。
①乳鼠和成年小鼠接種組 至少應有 80% 接種動物健存,且小鼠未顯示有可傳播性因子或其他病毒感染。
②雞胚接種組 卵黃囊接種的雞胚至少應有 80% 存活,且未顯示有病毒感染;尿囊腔接種的雞胚至少應有 80% 存活,且尿囊液紅細胞凝集試驗為陰性。
③豚鼠接種組 至少應有 80% 接種動物健存,且動物未顯示有可傳播性因子或其他病毒感染。
④家兔接種組 至少應有 80% 接種動物健存,且動物未顯示有可傳播性因子或其他病毒感染(包括接種部分損傷)。
(4)逆轉錄病毒及其他內源性病毒或病毒核酸的檢測
可采用下列方法對待檢細胞進行逆轉錄病毒的檢測。
①逆轉錄酶活性測定 采用敏感的方法,如產物增強的逆轉錄酶活性測定法( PERT 或 PBRT 法)(本通則附錄 1 或其他適宜的方法,但靈敏度不得低于現行方法),但由于細胞中某些成分也具有逆轉錄酶活性;因此,逆轉錄酶陽性的細胞,應進一步確認是否存在感染性逆轉錄病毒。
②透射電鏡檢查法 取至少 1×107 個活細胞采用超薄切片法進行透射電鏡觀察。
③ PCR 法或其他特異性體外法 根據細胞的種屬特異性,在逆轉錄酶活性結果不明確或不能采用逆轉錄酶活性測定時,可采用種屬特異性的逆轉錄病毒檢測法,如逆轉錄病毒 PCR 法、免疫熒光法、ELISA 法等,逆轉錄病毒的定量 PCR 法還可用于逆轉錄病毒顆粒的定量。
④感染性試驗 將待檢細胞感染逆轉錄病毒敏感細胞,培養后檢測。根據待檢細胞的種屬來源,須使用不同或多種的敏感細胞進行逆轉錄病毒感染性試驗。
不同的方法具有不同的檢測特性,逆轉錄酶活性提示可能有逆轉錄病毒存在,透射電鏡檢查及特異性 PCR 法可證明是否有病毒性顆粒存在并進行定量,感染性試驗可證明是否有感染性的逆轉錄病毒顆粒存在,因此應采用不同的方法聯合檢測。若細胞逆轉錄酶活性檢測為陽性,則需進行透射電鏡檢查或 PCR 法及感染性試驗,以確證是否存在感染性逆轉錄病毒顆粒。可產生感染性逆轉錄病毒顆粒,且下游工藝不能證明病毒被清除的細胞基質不得用于生產。
已知雞胚成纖維細胞(CEF)或其他禽源性細胞含有逆轉錄病毒序列,常可產生缺陷型逆轉錄病毒顆粒,逆轉錄酶活性為陽性,對這類細胞進行逆轉錄病毒檢測時,可直接檢測細胞基質中是否存在外源性逆轉錄病毒污染,如禽白血病病毒、禽網狀內皮病腫瘤病毒、感染性內源性逆轉錄病毒。在某些情況下,也可通過監測雞群,以保證無上述感染性逆轉錄病毒污染。
小鼠及其他嚙齒類動物來源的細胞系含有逆轉錄病毒基因序列,可能會表達內源性逆轉錄病毒顆粒,因此,對于這類細胞系,應進行感染性試驗,以確定所表達的逆轉錄病毒是否具有感染性。對于特定嚙齒類細胞(如 CHO、BHK21、NS0 和 Sp2/0),還應確定其收獲液中病毒顆粒的量及其是否有感染性逆轉錄病毒,并應在生產工藝中增加病毒去除和(或)滅活工藝。僅有高度純化且可證明終產品中逆轉錄病毒被清除至低于現行檢測方法的檢測限以下時,方可使用這類細胞。
(5)種屬特異性外源病毒因子的檢查
應根據細胞系/株種屬來源、組織來源及供體健康狀況等確定檢測病毒的種類。若在 MCB 或 WCB 中未檢測到種屬特異性病毒,后續過程中不再進行重復檢測。
鼠源的細胞系,可采用小鼠、大鼠和倉鼠抗體產生試驗(MAP、RAP 及 HAP)檢測其種屬特異性病毒。
人源的細胞系/株,應考慮檢測如人EB病毒、人巨細胞病毒(HCMV)、人逆轉錄病毒(HIV-1/2、HTLV-1/2)、人肝炎病毒(HAV、HBV、HCV)、人細小病毒 B19、人乳頭瘤病毒、人多瘤病毒、難培養的人腺病毒和人皰疹病毒 -6/7/8 等。
猴源細胞系/株應考慮檢測猴多瘤病毒(如 SV40)、猴免疫缺陷病毒(SIV)等。
這類病毒的檢測可采用適當的體外檢測技術,如分子檢測技術,但所用方法應具有足夠的靈敏度,以保證制品的安全。
(6)牛源性病毒檢測
若在生產者建庫之前,細胞基質在建立或傳代歷史中使用了牛血清,則所建立的 MCB 或 WCB 和(或)生產終末細胞至少應按照通則 3604 的要求檢測一次牛源性病毒。取待檢細胞用培養上清液制備成至少相當于 107 個活細胞/ml 的裂解物,進行檢測。如果在后續生產過程中不再使用牛血清,且 MCB 和(或)EOPC 檢測顯示無牛源性病毒污染,則后續工藝中可不再重復進行此項檢測。
(7)豬源性病毒的檢測
如果在生產者建細胞庫之前,細胞基質在建立或傳代歷史中使用了胰酶,則所建立的 MCB 或 WCB 和(或)超過生產限定水平的細胞至少應檢測一次與胰酶來源動物相關的外源性病毒,包括豬細小病毒或牛細小病毒。如在后續生產過程中不再使用胰酶,且 MCB 和(或)EOPC 檢測結果顯示無相關動物源性病毒污染,則后續工藝中可不再重復進行此項檢測。如使用重組胰酶,應根據胰酶生產工藝可能引入的外源性病毒評估需要檢測的病毒種類及方法。
(8)其他特定病毒的檢測
根據細胞的特性、傳代歷史或培養工藝等確定檢測病毒的種類。有些細胞僅對某些特定病毒易感,采用上述檢測方法無法檢出,因此需要采用特定的方法檢測,如對 CHO 細胞進行鼠細小病毒污染的檢測等。
6. 成瘤性檢查
成瘤性檢查是確定細胞基質在動物體內是否能夠形成腫瘤,是對細胞特性的鑒定。
新建細胞系/株及新型細胞基質應進行成瘤性檢查。
某些傳代細胞系已證明在一定代次內不具有成瘤性,而超過一定代次則具有成瘤性,如Vero細胞,因此必須進行成瘤性檢查。
用于疫苗生產的細胞系/株應進行成瘤性檢查,但當未經遺傳修飾的二倍體細胞被證明無成瘤性后,可不作為常規檢查要求。
已證明具有成瘤性的傳代細胞,如 BHK21、CHO、HEK293、C127、NS0 細胞等,或細胞類型屬成瘤性細胞,如雜交瘤細胞,用于生產治療性制品時可不再做成瘤性檢查。
成瘤性檢查的方法見本通則附錄 2。具有成瘤性的新建細胞或新型細胞基質,需采用定量的方法進一步分析細胞成瘤性的大小,并計算該細胞的半數致瘤量(TPD50),并根據生產工藝及制品的特性,評估成瘤性的風險。
體內法是成瘤性評價的標準,但對于某些細胞,也可采用軟瓊脂克隆形成試驗或器官培養試驗等體外法檢測細胞的成瘤性,特別是對于低代次、在動物體內無成瘤性的傳代細胞系。體外法的結果可作為細胞成瘤性評價的參考。
7. 致瘤性檢查
致瘤性檢查是保證細胞基質中不存在可使細胞永生化并具有形成腫瘤的因子。細胞基質致瘤性可能與細胞 DNA(或其他細胞成分)或細胞基質中含有致瘤性因子相關。來源于腫瘤的細胞或因未知機制形成腫瘤表型的細胞,含有致瘤性物質的理論風險性相對較高。
已建株的二倍體細胞,如 MRC-5、2BS、KMB17、WI-38 及 FRhL-2 新建主細胞庫不要求進行致瘤性檢查。
已建株的或有充分應用經驗的連續傳代細胞,如 CHO、NS0、Sp2/0、低代次的 Vero 細胞不要求進行致瘤性檢查。
新型細胞基質,特別是成瘤性為陽性的細胞,用于疫苗生產時,需進行致瘤性檢查。
可采用待測細胞裂解物和(或)細胞 DNA 按照本通則附錄 3 的方法進行致瘤性檢查。如根據細胞基質的表型或來源疑似有致瘤性病毒,建議用細胞基質裂解物接種動物進行致瘤性檢查;若細胞基質具有成瘤性表型,建議用細胞 DNA 接種動物進行致瘤性檢查。
對致瘤性檢查中出現進行性結節的細胞,應開展進一步的研究,鑒別致瘤性因子或致瘤性活性,并確定細胞的可適用性。
(五)生產用細胞培養
生產用原材料的選擇和細胞操作環境應符合本通則“一、(二)細胞培養操作要求”及“一、(三)1. 細胞庫的建立”中有關規定。
從凍存的 WCB 中取出 1 支或多支安瓿,混合后培養,傳至一定代次后供生產用。其代次不得超過該細胞用于生產的最高限定代次。生產用細胞的最高限定代次應根據研究結果確定,但不得超過國際認可的最高限定代次。從 WCB 取出的細胞經增殖后獲得的細胞不得再回凍保存用于生產。
二、連續傳代細胞系的特殊要求
傳代細胞系一般是由人或動物腫瘤組織或正常組織傳代或轉化而來,可懸浮培養或采用微載體培養,能大規模生產。這些細胞可無限傳代,但到一定代次后,成瘤性會增強。應按本通則“一、(四)細胞檢定”的規定進行細胞庫的檢查。對生產過程中細胞培養的要求如下。
1. 用于生產的細胞代次
用于生產的傳代細胞系,代次應有一定限制。用于生物制品生產的細胞最高限定代次須經批準。
2. 生產過程中的細胞檢查
除另有規定外,病毒類制品,在生產末期,取不接種病毒的對照細胞,按本通則“一、(四)1. 細胞鑒別試驗,2. 細菌、真菌無菌檢查,4. 支原體檢查”以及病毒外源因子檢查法(通則 3302),應符合規定。
三、人二倍體細胞株的特殊要求
新建的人二倍體細胞必須具有以下資料:建立細胞株所用胎兒的胎齡和性別、終止妊娠的原因、所用胎兒父母的年齡、職業及健康良好的證明(醫師出具的健康狀態良好、無潛在性傳染病和遺傳性疾患等證明),以及胎兒父系及母系三代應無明顯遺傳缺陷疾病史的書面資料。
人二倍體細胞株應在傳代過程的早期,選擇適當世代水平( 2~8 世代)增殖出大量細胞,定量分裝后,置液氮中或 -130℃ 下凍存,供建立細胞種子之用,待全部檢定合格后,即可正式定為細胞種子,供制備 MCB 用。
1. 染色體檢查及判定標準
新建人二倍體細胞株及其細胞庫必須進行染色體檢查。對于已建株的人二倍體細胞株,如 WI-38、MRC-5、2BS、KMB17 等,在建立 MCB 時可不必進行細胞染色體檢查;但如對細胞進行了遺傳修飾,則須按新建細胞株進行染色體檢查。
(1)染色體檢查
新細胞建株過程中,每 8~12 世代應做一次染色體檢查,在1株細胞整個生命期內的連續培養過程中,應至少有 4 次染色體檢查結果。每次染色體檢查,應至少隨機取 1000 個分裂中期細胞,進行染色體數目、形態和結構檢查,并做記錄,以備復查。其中至少選擇 50 個分裂中期細胞進行顯微照相,作出核型分析,并應粗數 500 個分裂中期細胞,檢查多倍體的發生率。
每次染色體檢查,應從同一世代的不同培養瓶中取細胞,混合后進行再培養,制備染色體標本片。染色體標本片應長期保存,以備復查。
可用 G 分帶或 Q 分帶技術檢查 50 個分裂中期細胞染色體帶型,并作出帶型分析。
(2)判定標準
對 1000 個和 500 個分裂中期細胞標本異常率進行檢查,合格的上限(可信限 90% Poison 法)見表 3。
2. 無菌檢查
每 8~12 世代細胞培養物,應進行無菌檢查,依法檢查(通則 1101),應符合規定。
3. 支原體檢查
每 8~12 世代細胞培養物,應進行支原體檢查,依法檢查(通則 3301),應符合規定。
4. 病毒檢查
二倍體細胞株傳代過程中,至少對 2 個不同世代水平進行病毒包涵體及特定人源病毒檢查[見本通則一、(四)5.(5)種屬特異性外源病毒因子的檢查],結果應均為陰性。
5. 成瘤性檢查
每 8~12 世代應做一次成瘤性檢查[方法見本通則一、(四)6. 成瘤性檢查],結果應無成瘤性。
6. 生產過程中的細胞檢查
除另有規定外,在生產末期,取不接種病毒的細胞作為對照,進行以下各項檢定,應符合規定。
(1)染色體檢查
可根據制品特性及生產工藝,確定是否進行生產過程中細胞的染色體檢查。通常含有活細胞的制品或下游純化工藝不足的制品,應對所用細胞進行染色體檢查及評價[見本通則三、1. 染色體檢查及判定標準];但如采用已建株的人二倍體細胞生產,則不要求進行染色體核型檢查。
(2)細胞鑒別試驗
按本通則“一、(四)細胞檢定”項下細胞鑒別試驗進行。生產用細胞每年應至少進行一次該項檢定。
(3)無菌檢查
依法檢查(通則 1101),應符合規定。
(4)支原體檢查
依法檢查(通則 3301),應符合規定。
(5)對照細胞外源病毒因子檢查
依法檢查(通則 3302),應符合規定。
四、重組細胞的特殊要求
重組細胞系通過 DNA 重組技術獲得的含有特定基因序列的細胞系,因此重組細胞系的建立應具有細胞基質構建方法的相關資料,如細胞融合、轉染、篩選、集落分離、克隆、基因擴增及培養條件或培養液的適應性等方面的資料。細胞庫細胞的檢查除應按本通則“一、(四)細胞檢定”的規定進行,還應進行下述檢查。
1. 細胞基質的穩定性
生產者須具有該細胞用于生產的目的基因的穩定性資料,穩定性檢測的項目及方法依據產品的特性確定,對于細胞基質來說,穩定性的分析是保證 MCB/WCB 與 EOPC 之間的一致性,包括重組細胞的遺傳穩定性(如插入基因拷貝數、插入染色體的位點、插入基因的序列等)、目的基因表達穩定性、目的產品持續生產的穩定性,以及一定條件下保存時細胞生產目的產品能力的穩定性等資料。
2. 細胞鑒別試驗
除按本通則“一、(四)1. 細胞鑒別試驗”進行外,還應通過檢測目的蛋白基因或目的蛋白進行鑒別試驗。
五、原代細胞的要求
原代細胞應來源于健康的動物臟器組織或胚胎,包括猴腎、地鼠腎、沙鼠腎、家兔腎、犬腎等動物臟器或動物的胎兒和其他組織,以及雞胚和鵪鶉胚等正常組織,以適當的消化液消化、分散組織細胞進行培養,原代細胞不能建立細胞庫,只能限于原始培養的細胞或傳代少數幾代內(一般不超過 5 代)使用,無法事先確定細胞代次。因此,只能嚴格規范管理和操作措施,以保證以原代細胞為基質所生產的制品質量。
(一)動物組織來源和其他材料
1. 動物組織來源
應符合“凡例”的有關要求。對各種動物都應有明確健康狀況和潔凈級別要求。
2. 生產或檢定用猴
多采用非洲綠猴、恒河猴等,中國以恒河猴為主。應為籠養或小群混養的正常健康猴。動物用于制備細胞前,應有6周以上的檢疫期,檢疫期中出現病猴或混入新猴,應重新檢疫。從外面新引入的猴群應做結核菌素試驗及猴皰疹I型病毒( B 病毒)的檢查。
胎猴腎可用于生產,對其母猴應進行檢疫。
(二)原代細胞培養物的檢查
用于細胞制備的動物剖檢應正常,取留的器官組織亦應正常,如有異常,不能用于制備細胞。
1. 細胞培養原材料檢查及細胞培養操作
按本通則“一、(二)細胞培養操作要求”項進行。
2. 細胞培養物的檢查
(1)細胞形態檢查
細胞在接種病毒或用于生產前,其培養物均應進行外觀檢查和鏡檢,應無任何可疑、異常和病變,否則不得用于生產。
(2)特定病毒檢查
原代猴腎細胞培養應檢查 SV40 病毒、猴免疫缺陷病毒和 B 病毒;應采用 Vero 或原代綠猴腎細胞、兔腎細胞檢查。地鼠腎原代細胞應采用 BHK21 細胞培養檢查。觀察細胞形態,如有可疑應在同種細胞上盲傳一代繼續觀察。
(3)對照細胞外源病毒因子檢查
依法檢查(通則 3302),應符合規定。
六、檢定用細胞的要求
檢定用細胞是指用于生物制品檢定的細胞,包括原代細胞、連續傳代細胞或二倍體細胞,以及經特定基因修飾過的細胞。檢定用細胞的質量對檢定結果的判定具有重要的影響,為保證檢定結果的有效性、可靠性及真實性,檢定用細胞應符合下列要求。
(一)細胞資料
1. 檢定用細胞應具有明確合法來源的證明資料。
2. 如使用傳代細胞系/株,應建立細胞庫體系,即主細胞庫及工作細胞庫,如細胞使用量較少,可建立單一主細胞庫。應根據制品特性,在保證檢測結果可靠性的基礎上,通過驗證確定該細胞允許使用的最高限定代次,在此基礎上規定檢定用細胞的使用代次范圍。檢定時從工作細胞庫復蘇細胞后,不能再回凍保存。
3. 應詳細記錄檢定用細胞建庫的過程,包括細胞培養所用原材料的來源、批號,細胞生長液的配制方法、使用濃度等,以及細胞的傳代及凍存過程,并建立細胞凍存及使用臺賬。
(二)細胞檢定
應至少進行以下 1~3 項檢定,根據檢定用細胞用途的不同,還應進行以下其他相關項目的檢定。
1. 細胞鑒別試驗
按本通則“一、(四)1. 細胞鑒別試驗”項進行,或其他適宜的方法,應確認為本細胞,并且無其他細胞的交叉污染。
2. 無菌檢查
依法檢查(通則 1101),應符合要求。
3. 支原體檢查
依法檢查(通則 3301),應符合要求。
4. 外源病毒因子檢查
采用本通則“一、(四)5.(2)體外不同指示細胞接種培養法檢測病毒因子”項及本通則“一、(四)5.(3)動物體內接種法檢測外源病毒因子”項檢查,應無外源病毒污染。
5. 其他檢測
(1)成瘤性檢查
用于成瘤性檢查的陽性對照細胞,應采用本通則“一、(四)6. 成瘤性檢查”項進行檢查,應具有成瘤性。
(2)病毒敏感性檢查
用于檢測活疫苗制品病毒滴度的細胞,應進行此項檢查,證明所用細胞具有足夠的相應病毒敏感性。
(3)細胞功能檢查
用于生物學活性、效力或效價測定的細胞,應進行此項檢查,證明所用細胞能夠有效評價待檢樣品質量。
附錄1 逆轉錄酶活性檢查法
本法系以噬菌體 MS2 RNA 為模板,經反轉錄后再采用實時熒光定量PCR法檢測特異性擴增信號,從而測定供試品中的逆轉錄酶活性。
試劑
(1)供試品稀釋液(A 液) 每 1L A 液含三羥甲基氨基甲烷-鹽酸( Tris-HCl,pH 7.5) 25mmol,氯化鉀 50mmol,二硫蘇糖醇( DTT ) 5mmol,乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2,pH8.0) 0.25mmol,TritonX-100 25ml,甘油 500ml。配制時,最后添加 DTT,混合后分裝,-20℃ 保存,備用。
(2)供試品保存液(B 液) 每 1L A 液中含 1mg 亮抑蛋白酶肽、0.7mg 抑胃肽及 1mg 抑蛋白酶肽。
(3)引物及探針序列
上游引物:5'-AACATGCTCGAGGGCCTTA-3'
反轉錄及下游引物:5'-GCCTTAGCAGTGCCCTGTCT-3'
探針:5'-(FAM)-CCCGTGGGATGCTCCTACATGTCA-(TAMRA)-3'
(4)模板 噬菌體 MS2 RNA。
(5)反轉錄緩沖液 每1L反轉錄緩沖液含 Tris-HCl(pH8.3) 50mmol,氯化鉀 40mmol,氯化鎂 6mmol,DTT 2mmol,脫氧核糖核苷酸 200μmol,下游引物 0.8×10-3mmol。
(6)擴增緩沖液 可采用市售熒光定量PCR混合液(Mix),每 30μl 反應體系中,加入上、下游引物各 2×10-8mmol,探針 6×10-9mmol,核糖核酸酶 A 10μg。若 Mix 中不含有 Taq DNA 聚合酶,可加入 2U 的 Taq DNA聚合酶。
供試品、陽性對照及靈敏度對照的制備
(1)取供試品 200μl,每分鐘 5000 轉離心 5 分鐘,取上清液 100μl,加入 B 液 100μl 和焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的 5%TritonX-100 2μl,混勻后,置冰浴 15 分鐘后,置-70℃ 保存備用。
(2)陽性對照 用 Sp 2/0 細胞培養上清液作陽性對照,同(1)處理后,按單次使用量分裝,-70℃ 保存備用。
(3)標準曲線及靈敏度對照制備 取 0.5μl 莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶(M-MLVRT)(200U/μ1)加至 99.5μl A 液中,上下吹打 10 次并渦旋混勻,即將M-MLVRT稀釋為 1012pU/μl(1U/μl)。以此樣本為初始樣本,取 5μl 至 45μl A 液中,上下