一步生成條件性基因敲除小鼠ESC

　　最近發展的基因組編輯工具，包括轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs）和CRISPR/Cas9，使我們能夠通過誘導雙鏈斷裂（DSBs）的非同源末端連接（NHEJ）修復，快速而有效的敲除靶向基因。然而，這種方法不能進行必需基因的功能研究，這類研究通常采用的策略是基于Cre-LoxP系統的條件性基因敲除（cKO）。

　　這就需要通過同源重組（HR）和誘導Cre重組酶表達，進行loxP位點的靶向整合（敲入）。Cre融合蛋白和 人類雌激素受體ERT2的突變配體結合域，常用于4-羥基他莫昔芬（4OHT）對Cre重組酶活性的控制，4OHT可促進CreERT2從細胞質到細胞核 的易位，在那里Cre可識別和重組嵌入基因組DNA的loxP位點。4OHT控制的基因敲除，不僅能讓我們選擇一個時間窗，在一個必需基因表現出其致命表 型之前，研究它的功能，而且也能讓我們評估一個基因缺失的直接影響。

　　產生誘導型CKO小鼠胚胎干細胞（mESCs） 的傳統方法是非常費時、費力的，需要產生和雜交攜帶靶向cKO（兩端各放一個loxP序列）等位基因的小鼠。最近，在小鼠受精卵中Cas9刺激的、含 loxP的單鏈寡脫氧核苷酸（ssODNs）的整合，可簡化CKO mESC的生產，但仍然依靠使用活體動物。為了遵循減少使用實驗動物的原則，簡化并加快CKO MESC的生產過程，研究人員一直都在試圖提高工程核酸酶介導的HR事件，這將允許直接向mESCs插入LoxP位點。

　　七月十四日，來自瑞士巴塞爾大學、Friedrich Miescher生物醫學研究所的研究人員在Cell子刊《Cell Reports》發表一項研究成果，題為“Single-Step Generation of Conditional Knockout Mouse Embryonic Stem Cells”。這項研究介紹了一種新的報告系統，可讓我們一步實現高效的CKO mESCs體外生成，也能進行雙等位基因的內源基因標記。

　　在這項研究中，研究人員開發了體外產生無標記cKO mESCs和內源基因標記的試劑和流程。這種方法是基于重組報告質粒，它們賦予了EGFP熒光性或嘌呤霉素對工程核酸酶誘導的DSB修復的抗性。不同于先 前公布的報告系統——依賴于容易出錯的DSB NHEJ修復，這種新的報告系統，僅在HR修復后變得功能性，從而同時報告工程核酸酶的活性和HR通路的活性。

　　這種新方法首次使我們能夠在一次轉染步驟中，直接在mESCs的外顯子雙等位基因兩側各放一個LoxP位點。利用這種已確立的父母RosaC (Rosa26CreERT2/-)細胞系，任何配備基本細胞培養和分子生物學設備的實驗室，可在不到3周的時間內，獲得CKO mESCs。

　　與TALEN或CRISPR/Cas9核酸酶通常所誘導的靶基因敲除相比，cKO策略使我們能夠對必需基因進行功能缺失分析。它也排除了對觀察到的 基因敲除表型的誤解，這些表型可能是由TALEN或Cas9基因組編輯相關的潛在脫靶效應引起的。這種選擇程序的瞬態性質，可避免選擇標記的基因組插入， 使我們能夠在同一細胞系中產生多個cKO等位基因。

　　最后，作者強調，雖然他們建立了與TALENs和mESCs相結合的重組報告系統，但它可能同樣也與CRISPR/cas9系統強勁結合，并在多種細胞類 型和生物體中使用。當基因組靶位點的序列特性不能使用一種可用的基因組編輯系統時，靈活地選擇一種特殊的基因組編輯核酸酶，將是特別重要的。