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    表1 計算濃度和變異系數,以分析B/jiangsu/10/2005(圖3)

       

    SRID

        血清以Cy3-染料標記。未標記的血清和Cy3-標記的血清(小于總血清量的0.5%;證實不會干擾沉淀)與熔化的瓊脂糖混合,澆鑄在模中,以形成凝膠中的孔。樣品和參照抗原在加入凝膠孔之前,用1%的兩性洗滌劑Zwittergent在-22處理30分鐘。凝膠在-22 15-18個小時,隨后干燥,并在Typhoon的450nm下掃尾。利用ImageQuant TL軟件將樣品的環狀區與參照抗原比較,從而進行評估。儀器和軟件皆來自通用電氣醫療集團。

     

        結果

        圖2分別顯示了三個分析(B、H3N2和HlNl)的典型校準曲線。校準曲線的動態范圍優化到0.5-10 ug/ml產生的回收率在98-102%。根據參照抗原的連續稀釋(低至0 ug/ml),所有三種亞型的檢測極限預計低于0.5 ug/ml,定量極限約1ug/ml。圖1顯示了在重組HA表面上重復注射不同濃度(0.5-16 ug/ml)的B/Jiongsu/10/2005血清和抗原后的相對響應。計算出的濃度顯示在表1。

     

        曾提到響應會隨時間而降低,這在最初10-20個循環中最大,之后隨循環數增加而穩定。所有待測的參照抗原在個自的表面也檢測到類似的結果,改變再生條件或者用去污劑預處理樣品也不會對其產生影響(數據未顯示)。為了增加分析的準確性,運行了三個校準曲線,樣品濃度是由差值校準曲線來確定的,如第2部分所示。

     

     

    圖2 A/H3N2(A)、B(6)和A(H1N1)的校準曲線,相應血清中各種參照抗原的濃度范圍在0.5-8 ug/ml。校準曲線是在初期、中期和后期運行的,析了約40個未知樣品。

     

     

     

     

        為了研究針對不同毒株的血清與表面上重組HA蛋白之間相互作用的特異性,在所有三個表面上分析了不同毒株的抗血清(圖4)。血清在參照抗原(2 ug/ml)和無參照抗原下進行檢測,以確認反應是相應病毒所特異的,以及病毒本身不會產生非特異的背景影響。結果表明固定在表面的三種重組HA蛋白分別是三類亞型A/H1N1、A/H3N2和B血清所特異的,而對于同亞型病毒內的毒株之間則是通用的。所有血清中只有一種能與所有表面結合(雞/H1N1/PR/8/34血清,數據末顯示)。其中的原因目前未知。可能是雞來源的成分引起了非特異響應,而其它血清都來自綿羊。


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