一種新型細胞劃痕實驗方法的介紹

一.傳統細胞遷移實驗技術—劃痕實驗

1.基本原理

細胞劃痕（修復）法是簡捷測定細胞遷移運動與修復能力的方法，類似體外傷口愈合模型，在體外培養皿或平板培養的單層貼壁細胞上， 用微量槍頭或其它硬物在細胞生長的中央區域劃線，去除中央部分的細胞，然后繼續培養細胞至實驗設定的時間（例如72h），取出細胞培養板，觀察周邊細胞是否生長（修復）至中央劃痕區，以此判斷細胞的生長遷移能力，實驗通常需設定正常對照組和實驗組，實驗組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等的組別，通過不同分組之間的細胞對于劃痕區的修復能力，可以判斷各組細胞的遷移與修復能力。

2、操作步驟

（1）先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻的劃橫線，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。

（2）在孔中加入約5×105個細胞，具體數量因細胞種類不同而不同，接種原則為過夜后融合率達到100%。

（3）第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜(不同孔之間最好使用同一只槍頭)。

（4）PBS洗細胞3次，去處劃下的細胞，加入無血清培養基。

（5）放入37℃ 5% CO2培養箱，培養。可按0，6，12，24h時間點取樣，拍照(具體時間依實驗需要而定)。

（6）統計方法：使用Image J軟件打開圖片后，隨機劃取6至8條水平線，計算細胞間距離的均值。
 

3.注意事項：

（1）在用PBS緩沖液沖洗時，貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細胞，影響實驗拍照結果。

（2）一般做劃痕實驗，都是無血清或者低血清（<2%）否則細胞增殖就不能忽略。

（3）按照6孔板背后畫線的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點，作為固定的檢測點，以解決了前后觀察時位置不固定的問題。

二．傳統實驗方法主要問題

傳統實驗方法缺點是細胞增殖對實驗結果有影響，即使在無血清或低血清條件時，細胞的狀態、代謝等方面會受到影響，由于細胞內信號傳導系統整體性的下調，細胞遷移的速度也會慢很多；另外創建“傷口”也可能時大時小，邊緣不整齊等誤差；還有在鏡下拍照觀察時，每次觀察點基本不可能做到完全一致等。

三．最新實驗解決方法-------傷口愈合劃痕插件
 

可黏附底部；生物相容硅膠材料；9 mm x 9 mm x 5 mm；兩孔（70μl/孔）；每孔生長面積0.22 cm2；可產生500 μm寬的“gap”  

特點：

1. 在一定程度上模擬了體內細胞遷移的過程。

2. 非常適合研究細胞與胞外基質（ECM），細胞與細胞之間相互作用引起的細胞遷移。

3. 與包括活細胞成像在內的顯微鏡系統兼容，可用于分析細胞間的相互作用。

4. 研究細胞遷移的體外實驗中最簡單的方法。
 
細胞培養插件方法與傳統劃痕實驗比較

細胞培養插件提供重復性更好的實驗結果：

左圖是傷口愈合插件做出的實驗數據統計；右圖是槍頭劃痕做出的實驗數據統計

四.方案小結

（1） 新型細胞劃痕實驗方法可以保證劃痕的標準化，保證了實驗的重復性－對比槍頭劃痕，劃痕會歪歪扭扭，無法保證每次都一樣；

（2）新型細胞劃痕實驗方法可以避免槍頭劃痕會傷到包被；手動劃痕傷到包被的話，會直接影響了細胞遷移的結果；

（3）直接鏡檢觀察，成像效果良好；

（4）新型細胞劃痕實驗方法有配套的圖像分析，圖像分析是通過計算實驗區域的空白面積來計算愈合情況的，比分析計算的要更客觀準確；

（5）產品用法簡介： 只需要在插件的兩個孔里種細胞，等細胞貼壁了再拔掉這個插件，細胞之間就會留下一道標準的劃痕，就可以開始定時觀察細胞愈合的情況了；

（6）多種規格適合不同的實驗流程，2孔，3孔，4孔，帶培養皿或者插件，細胞追蹤實驗專用插件培養皿等。