一種用于檢測和定量分析細胞代謝物的HILICLCMS方法

引言

復雜生物樣品通常包含大量可反映有機體代謝狀態的內源性代謝物。特別是骨骼肌可根據其是快收縮肌(白色肌肉，糖酵解型)還是慢收縮肌(紅色肌肉，氧化型)而表現出特征性的代謝組“指紋圖譜”。例如，紅色肌肉應顯示一種富含線粒體代謝物(如三羧酸循環)的代謝組指紋圖譜;而白色肌肉應顯示富含糖酵解代謝物的代謝組指紋圖譜，其線粒體代謝物的濃度大大低于紅色肌肉。雖然很多這類代謝物可具有較強的極性，但這些樣本通常使用反相液相色譜-質譜(RP-LC-MS)進行分析，由此而來的多是較差的保留。在本研究中，我們開發了一種用于檢測和定量強極性細胞代謝物的新穎LC-MS方法。本研究采用了基于亞2微米顆粒BEH酰胺柱的親水作用液相色譜(HILIC)，并聯用了雜化四極桿飛行時間質譜儀和三重四極桿質譜。

方法

這些試驗借助聯用了沃特世SynaptTM HDMSTM、沃特世Synapt G2 HDMS和Xevo TQ的一臺UPLC系統而進行：

液相色譜條件

(1)：使用堿性流動相 液相色譜系統：沃特世ACQUITY UPLC?系統 - 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 酰胺基柱，2.1×100mm，1.7μm - 柱溫：45℃ - 流速：500μL/分鐘 - 堿性流動相A：乙腈/水，95/5(v/v)，10mM醋酸銨，pH=9.0 - 堿性流動相B：乙腈/水，50/50(v/v)，10mM醋酸銨，pH=9.0 - 梯度(采用堿性流動相進行分離時)：線性梯度，先用2% B - 85% B洗脫8分鐘，然后在98% B的水平下保持2分鐘，接著返回到2% B的水平進行再平衡(5分鐘) - 進樣量：5-20μL

液相色譜條件

(2)：使用酸性流動相 液相色譜系統：沃特世?ACQUITY UPLC?系統 - 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 酰胺基柱，2.1×100mm，1.7μm - 柱溫：40℃ - 流速：600μL/分鐘 - 酸性流動相A：乙腈/水，95/5(v/v)，10mM醋酸銨，pH=3.0 - 酸性流動相B：水，10mM醋酸銨，pH=3.0 - 梯度：先用5% B - 30% B洗脫5分鐘，在第5.5min時升至60% B并保持7分鐘，接著返回到5% B的水平進行再平衡(5分鐘) - 進樣量：20μL滿定量環

質譜分析 Synapt HDMS和Synapt G2 HDMS 該質譜儀在正離子MSE模式下運行。所用的毛細管電壓為3.0kV，源溫度和去溶劑化溫度分別被設定為120℃和400℃。 在MSE采集模式下，儀器交替在低、高碰撞能量狀態下進行交替掃描。這樣可在一次分析內同時收集所有分析物的母離子和碎片離子的信息，消除了諸如DDA等其它常規方法所帶來的采樣偏差;在常規方法中，特定的m/z必須在碎片化前被分離出來。 Xevo-TQ質譜 Xevo TQ可同時在正離子和負離子模式下運行。毛細管電壓為3.0kV，源溫度和去溶劑化溫度分別被設定為150℃和650℃。去溶劑化氣體流速被設定為1200L/小時，碰撞氣體(氬)的流速為0.18mL/分鐘(4×10-3毫巴)。MS1/MS2分辨率被設置為單位質量(0.75Da FWHM)。

組織提取物的樣品制備 紅色的比目魚肌(S)用來與白色的腓腸肌(G)進行比較，肌肉從禁食一整夜的BALB/c小鼠中切下并進行了急速冷凍。代謝物通過組織均質化的方法在 1:1的甲醇：水混合溶劑中進行萃取，脂質通過將氯仿以1:1的比例添加至甲醇/水萃取液中而得到去除。去脂質后的組織萃取樣本分別用400μL和 4000μL的90:10乙腈：水混合溶劑進行揮干復溶。由于某些組分的含量高于定量上限，因此也對每份樣本再稀釋10倍進行了分析。

結果和討論

1. 通過聯用Synapt HDMS的UPLC進行HILIC LC-MS方法開發

1. 108種標準強極性細胞代謝物的總離子色譜圖，其中包括氨基酸、DNA/RNA堿基及其磷酸鹽、輔酶A、B族維生素、有機酸等。

圖1給出了108種標準強極性細胞代謝物的總離子色譜圖(TIC)，其中包括氨基酸、DNA/RNA堿基及其磷酸鹽、輔酶A、B族維生素、有機酸等。此項試驗通過聯用沃特世Synapt HDMS(正離子MSE模式下)的沃特世UPLC【液相色譜條件(1)】而進行。

圖2. 單一化合物提取離子色譜圖示例(50mDa窗口內)

圖2給出了關于單一化合物提取離子色譜圖片段(50mDa窗口)的一些例子。所選取的提取離子色譜圖中的大部分峰寬測定值介于5-15秒之間。然而，也觀察到了拖尾峰，其峰寬長達60秒。因此，我們考慮修改液相色譜的條件。

2. 使用UPLC/Xevo-TQ聯用儀器對HILIC LC-MS方法開發標準品和細胞萃取物進行定量分析 在UPLC優化過程中進行的標準品分析表明使用酸性pH的流動相緩沖液可提高對氨基酸和有機酸的分辨率、信噪比和峰對稱性。圖3比較了對一種包含約 2μg/mL L-賴氨酸的純氨基酸溶液所得出的兩幅MRM色譜圖。靠上的色譜圖通過使用堿性流動相(液相色譜條件1)所進行的分離而得出，而靠下的色譜圖則采用酸性流動相(液相色譜條件2)。

圖3. 比較不同pH下，包含約2μg/mL L-賴氨酸溶液的兩幅MRM色譜圖

圖4. 液相色譜條件(2)得出的MRM色譜圖示例 圖4將酸性流動相(液相色譜條件(2))下1600ng/mL校準標準品(上圖)和樣本H-S(0090)的MRM色譜圖進行了疊加。 在此條件下，我們成功分離并定量分析了28種化合物，其中包括氨基酸、有機酸和磷酸鹽(圖6)。

圖5. TargetLynx給出的ADP電子報告示例 .

圖6. 使用堿性(左表)和酸性(右表)流動相在H-S和H-G組織樣本中所檢出化合物的濃度計算結果總合 對在堿性和酸性流動相分離中所檢出的H-S和H-G組織樣本中的每種化合物均計算了分析物濃度。通過比較紅色比目魚肌(S)和腓腸肌(G)組織樣本中的代謝物濃度證實了在其相對濃度方面存在顯著差異。 3. 通過聯用Synapt G2的UPLC對HILIC LC-MS方法的標準品和細胞萃取物進行定量分析 最近開發的用于Synapt G2的QuanTof技術[1]以及MSE數據采集技術的應用實現了一種通用型UPLC-MS方法的開發;這種方法可在一次運行分析得到提供所有物質的定量和定性信息，既包括母離子信息也包括產物離子的信息。對于此項測定而言，系列稀釋標準品以及H-S和H-G樣本的數據都進行了采集(圖7)，所有的數據處理工作在采集完成后進行。

圖7. 全掃描色譜圖比較。通過UPLC-Synapt G2獲取的S和G細胞萃取物的數據。

圖8. 目標化合物的鑒定和定量結果

首先，自動篩選細胞萃取物中是否存在目標化合物。離子的鑒定和確認通過一個單一處理步驟使用Posit±veTM軟件包得出母離子和子離子的準確質量(2mDa窗口)而實現(圖8)。 該數據表明與Xevo TQ分析結果具有良好的一致性。圖8給出了一個示例，化合物L-脯氨酸在細胞萃取物中被明確鑒別出來，并在4個數量級中表現出線性的動態范圍響應，RMS 質量誤差為0.57mDa。

結 論 ·使用新型BEH Amide酰胺柱可開發出一種用于分離極性組織細胞代謝物的HILIC LC-MS方法，總運行時間不到15分鐘。 · 同時采用Xevo TQ和Synapt G2 HDMS對紅色和白色的肌肉組織萃取物進行定量分析，可明顯區分出其主要代謝物(比如AMP、ADP和ATP、以及瓜氨酸)的顯著不同。 · QuanTof技術實現了定性和定量試驗能夠在Synapt G2上同時進行。