一種針對細胞表面受體進行抗體篩選的多重分析方法一

本文以人EGFR抗體與細胞表面EGFR抗原結合為例，描述TTP Labtech的mirrorball儀器作為一種“mix-and-read”方法在在抗體篩選中的應用。EGFR配體的蛋白家族參與了細胞遷移，粘附和分化等活動，包括乳腺癌，肺癌，結腸癌在內的許多疾病都和EGFR的過度表達有著密切的關系。

不同靶蛋白的單克隆抗體的應用領域不斷擴大，可以用于不同疾病的治療和診斷（譬如癌癥，自身免疫性疾病）。單克隆抗體是特定細胞系針對特定抗原的分泌到細胞培養基中的生物蛋白，而高通量篩選是抗體開發的重要組成部分。

ELISA和Mix-and-read

利用傳統ELISA技術在進行抗體篩選時有許多局限性，由于ELISA技術依賴于微孔板上包被的抗原，所以該方法不適合檢測低溶解性的抗原（譬如細胞表面受體）。由于ELISA的操作方式，使得ELISA很難進行識別細胞表面抗原天然構象的抗體的篩選。即使對于可溶性抗原抗體篩選，由于微孔板對檢測抗體的吸附從而改變蛋白構象，繼而無法識別抗原特定抗原表位。

一種“mix-and-read”分析方法在生物制藥行業的單克隆抗體篩選領域得到廣泛應用。這種”mix-and-read”分析方法是將所有分析組分加到一個孔中，繼而孵育從而使得結合達到平衡。對于抗體篩選，該方法可以利用包被抗原的珠子或者表達抗原的細胞進行分析，抗原抗體的相互作用可以通過結合在珠子或者細胞的熒光標記的偶聯物的熒光強度進行檢測。結合的熒光可以利用細胞技術儀無需洗滌進行分析，以達到區分測試孔中結合和游離的熒光。Lee等在發明FMAT時，詳細介紹了相比傳統ELISA方法細胞計數儀的優勢。相對于傳統的ELISA分析方法，利用該技術分析“mix-and-read”實驗可以提高檢測的靈敏度和分析的通量，同時也提高抗體的識別和檢測。

高速的多重分析

TTP LabTech的mirrorball非常適合這種“mix-and-read”實驗的分析，由于其靈敏度很高，從而可以檢測低豐度表達的細胞膜蛋白。該儀器不僅能夠快速進行單激光掃描，而且可以同時進行405,488,640nm激光掃描，因此可以進行多種熒光素的選擇。其可以不依賴于激發光直接對發射熒光進行矯正的能力，從而在抗體篩選應用中可以對珠子和細胞進行多重分析。

該文章中以人EGFR抗體與細胞表面EGFR抗原結合為例，描述TTP Labtech的mirrorball儀器作為一種“mix-and-read”方法在在抗體篩選中的應用。EGFR配體的蛋白家族參與了細胞遷移，粘附和分化等活動，包括乳腺癌，肺癌，結腸癌在內的許多疾病都和EGFR的過度表達有著密切的關系，因此抑制EGFR的表達和激活在治療這些疾病過程中起著非常重要的作用。

為了檢測mirrorball的檢測敏感性，該通訊利用兩種高表達EGFR的上皮癌細胞系A549和A431進行檢測不同濃度的抗EGFR受體與EGFR的結合能力的分析。傳統篩選方法是采用表達和不表達抗原的細胞分別進行抗體的結合能力以達到篩選抗原特異性的抗體，譬如利用轉染目的基因的細胞和未進行轉染的宿主細胞進行反篩選。如果利用已有的篩選平臺（例如： ELISA和FMAT），需要進行制備兩種板以比較抗體對這兩種細胞的結合能力，從而確定抗原特異性的結合能力。

在該實驗中，mirrorball可以在一個細胞微孔板中對多種細胞進行抗體結合能力的測定，以區分抗體對不同細胞的特異性結合。mirrorball的這種多元化分析能力在大大降低實驗的成本的同時，可以提高篩選的通量，排除微孔板之間的差異。