丁強團隊建立安全高效的新型冠狀病毒細胞培養模型

　　SARS-CoV-2的爆發嚴重影響了人們的生產和生活，并奪走了很多人的生命。現在雖然有緊急批準使用的疫苗，但治療新冠肺炎的特效藥還有待開發。特別是病毒突變株（例如英國株、南非株和巴西株等）的出現，使得現存疫苗的有效性需要進一步評估。SARS-CoV-2需要在生物安全等級三級（BSL-3）實驗室進行研究，然而BSL-3實驗室數量有限，這就阻礙了對SARS-CoV-2的基礎病毒學研究以及抗病毒藥物的開發。

　　2021年3月12日，清華大學醫學院丁強課題組在PLOS Pathogens雜志上在線發表題為A novel cell culture system modeling the SARS-CoV-2 life cycle（一種模擬新冠病毒生命周期的新型細胞培養系統）的研究論文。該論文首次報道了以核衣殼蛋白反式互補為基礎的SARS-CoV-2遺傳學操作系統，使得對SARS-CoV-2的研究可以在生物安全等級二級（BSL-2）實驗室進行，為病毒學基礎研究、藥物篩選、中和抗體檢測和疫苗評價提供了有力工具。

　　SARS-CoV-2的核衣殼（N）蛋白是病毒顆粒組裝必需的結構蛋白。在本論文中，研究人員將SARS-CoV-2基因組中的N基因刪除，并替換成報告基因（此處為綠色熒光蛋白GFP），將SARS-CoV-2 GFP/ΔN的cDNA分A-E五個DNA片段擴增（其中A片段上游為T7啟動子），酶切后體外連接，利用T7聚合酶體外轉錄得到SARS-CoV-2 GFP/ΔN 基因組RNA。研究人員將該RNA轉染到病毒包裝細胞系(利用慢病毒轉導方法，制備穩定表達病毒N蛋白的人來源的Caco-2細胞，命名為Caco-2-N細胞)后，即可產生出N基因缺失的重組病毒。此重組病毒僅可以在表達病毒N蛋白的細胞中完成生命周期，保證了系統的安全性，該實驗體系命名為SARS-CoV-2 GFP/ΔN VLP（病毒樣顆粒）系統（圖1）。研究人員將SARS-CoV-2 GFP/ΔN VLP連續傳代一個月后，通過深度測序沒有檢測到N基因重組到病毒基因組上，說明了該系統的安全性。

　　為了進一步提高系統的安全性，研究人員利用蛋白質反式剪切技術（Intein）將N的cDNA拆成2部分，分別和Intein的N端和C端連接，在兩個獨立載體中表達，進一步降低了N基因和病毒基因組重組的可能。表達后產生的2個蛋白在intein的介導下重組成全長的病毒N蛋白，發揮其功能。該系統產生的病毒樣顆粒的感染能力可被新冠中和抗體、可溶性ACE2、干擾素、瑞德西韋以及GC376

　　(SARS-CoV-2蛋白酶抑制劑)所抑制。該系統為研究N蛋白的功能提供了便利，研究人員發現SARS-CoV的N蛋白在功能上跟SARS-CoV-2的N蛋白相似，而MERS-CoV的N蛋白則差異較大，為我們理解冠狀病毒的親緣關系提供了重要依據；同時，研究人員利用該系統，發現N蛋白特定位點（S188和S206）的磷酸化修飾對N蛋白發揮功能至關重要。最后，研究人員利用該系統建立了藥物高通量篩選平臺，從約400種化合物中找到了5種能夠高效抑制SARS-CoV-2重組病毒感染的化合物，并在真病毒感染情況下驗證了其效果。

　　除此之外，丁強課題組與清華大學生命科學學院張強鋒課題組合作，利用SARS-CoV-2 GFP/ΔN VLP系統證明了SARS-CoV-2基因組RNA二級結構的重要功能，并且篩選到了靶向宿主蛋白的抗病毒藥物【1】；丁強課題組還與上海科技大學黃行許課題組合作，利用SARS-CoV-2反式互補系統，證明病毒核衣殼N蛋白可以跟宿主G3BP蛋白發生相變，從而解聚應激顆粒，促進病毒感染【2】。目前，丁強課題組正在和清華以及其他科研單位的課題組進行合作，利用該系統開展創新藥物發現以及病毒和宿主相互作用的研究。

　　綜上所述，SARS-CoV-2 GFP/ΔN VLP為研究SARS-CoV-2基礎病毒學，解析病毒與宿主相互作用，評價抗病毒藥物和中和抗體效果以及新藥開發提供了重要的研究工具。