三代明星：PacBio及其序列數據

再來看看江湖呼聲漸漲的三代測序技術。目前三代測序市場上，表現最為搶眼的莫過于以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies為代表的納米孔單分子測序技術。與前兩代相比，三代測序最為核心的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增。

PacBio SMRT技術其實也應用了邊合成邊測序的思想，并以SMRT芯片為測序載體。測序時，不需要對目標DNA進行PCR擴增，而是直接在目標片段兩端加上兩個發卡結構的接頭，形成一個連續的環狀結構。也因此，PacBio系統在讀長上顯示了極大的優勢。目前比較受市場熱捧的三代測序是PacBio的RSⅡ和2015年推出的Sequel。

PacBio下機產生的序列文件以HDF5格式存儲。可以采用h5dump命令來查看H5文件內容。

1. 查看堿基序列：

h5dump –d /PulseData/BaseCalls/Basecall raw.h5 > Basecall.info ,文件內容如下：

DATA {(0): 67, 71,67, 67, 65, 71, 67, 71, 65, 65, 84, 71, 71, 67, 84, 71, 67, (17): 71, 71, 71,71, 65, 65, 71, 67, 65, 71, 65, 65, 65, 84, 84, 65, 84, (34): 67, 67, 71, 84,65, 65, 65, 67, 84, 71, 84, 84, 71, 67, 84, 71, 67,

該文件采用的ASCII碼的編碼方式存儲的堿基序列：A=> 65, C=>67, G=>71, T=>84。

2. 查看堿基質量值：

h5dump -d /PulseData/BaseCalls/QualityValue raw.h5 > Basecall.quality,

文件內容如下,其堿基質量值采用與illumina技術一致：

DATA {(0): 51, 44,42, 44, 24, 24, 51, 51, 51, 51, 50, 20, 20, 20, 50, 51, 51, (17): 48, 48, 48,47, 9, 9, 9, 51, 51, 46, 31, 31, 31, 31, 44, 51, 51, 30, (35): 30, 51, 51, 7,7, 7, 7, 51, 51, 44, 44, 44, 51, 51, 50, 27, 27, 26,

長到天際：Nanopore及其序列數據

Oxford Nanopore 公司2005年在英國牛津成立，其運用的納米孔測序技術使得DNA鏈在一個單通道中就能夠被解碼和識別，而不需要將長鏈打斷成小短鏈。由于實現了DNA聚合酶內在自身的延續性和反應速度，Nanopore讀長更長速度更快；同時由于能直接檢測每個堿基的特征性電流，因而能對修飾堿基進行測序，對于表觀遺傳學研究具有極高的價值；因此，這款長到天際的測序儀，非常有潛力橫掃當前測序格局。

2014年春天推出U盤大小的便攜式MinION測序儀，儀器售價僅需$1000，據官網報道最長Reads可長達960 Kb，2014年10月推出平板大小的臺式測序儀PromethION，有48個flow cell，可以單獨運行也可以并行，2017年推出桌面式GridION X5測序儀。

Nanopore目前還主要在測試和生產階段，尚未大規模應用，其應用主要體現在微生物等小基因組生物上。推出至今，其最亮眼的表現莫過于2014年西非埃博拉病毒爆發，MinION以最快的速度破譯病毒序列，名噪一時。隨著獨特的納米孔技術的成熟和完善，未來在即時檢測、太空應用、大眾檢測等方面會有很大的想象空間。

Nanopore測序得到的序列文件的格式基礎也是HDF5（https://support.hdfgroup.org/HDF5/），下機產生后綴為Fast5的序列文檔。Fast5文件可經由Poretools軟件（http://poretools.readthedocs.io/en/latest/）轉換為Fastq文件或Fasta，然后進行后續數據分析。

① 應用Poretools將fast5轉換為fastq，示例見：

http://poretools.readthedocs.io/en/latest/content/examples.html#poretools-fastq

② 應用Poretools將fast5轉換為fasta，示例見：

http://poretools.readthedocs.io/en/latest/content/examples.html#poretools-fasta

總結一下，在測序市場中，一代測序因其準確度高，仍作為突變檢測、單菌鑒定等的金標準而存在；以illumina HiSeq和MiSeq為代表的二代測序勢頭強勁，主打低成本和高通量，2017新機型NovaSeq更宣稱已將測序成本降至百美金；科研市場上三代測序最常見的莫過于PacBio，輔以冉冉上升的新星Nanopore等，主打長讀長策略，直擊二代測序碎片化序列的軟肋，在基因組de novo上表現不俗，錯誤率較高，但可被矯正。

回到我們今天的主題---數據格式上，一代測序主要是讀取峰圖文件后轉化為Fasta格式；二代測序中illumina原始讀取數據為BCL，下游分析中轉化為Fastq格式；454下機序列為SFF格式，后續分析中轉化為Fna-Qual格式使用；Ion Torrent下機序列為WELLS格式，下游分析中轉化為Bam格式；三代測序的兩大主流系統PacBio和Nanopore，其下機數據都以HDF5格式為基礎，后續轉化為Fastq格式進行下游分析。

不管一代、二代還是三代的數據分析中，原始下機數據都以二進制文件為主，原因無他，相比于文本文件，二進制文件在存儲上更為經濟集約。二進制文件本身是難于閱讀的，并且很難改動，所以，我們可以樂觀的認為，二進制文件造假的可能性是很低的。二進制的數據拿到之后，我們想要把數據轉換成正常人能看懂的格式，這時身為文本文件的Fastq就應運而生了，Fastq文件會被用于質控及比對等后續分析。

總之，Fastq是當前最為主流認可的序列數據存儲格式，不管哪一代測序技術，什么樣的原始數據，都免不了要打上Fastq格式的烙印，Fastq文件的格式及使用已經成為高通量測序學習中當仁不讓的第一站。