這種DNA提取方法已被優化用于從人類糞便樣本中提取高分子量(HMW)DNA，但也已在模擬微生物群落和細菌分離株上得到驗證。我們希望該方案可以適用于其他樣品類型，盡管可能需要對裂解前和裂解后步驟進行修改以解釋特定于樣品的制備和污染物清除的問題是必要的。機械裂解方法（如珠子擊打）仍然是連續裂解和下游相對豐度分類的金標準，因為與酶解法相比，機械裂解法的偏差更小。然而，我們以前已經證明，這種酶解法對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性的生物都能進行相對一致的裂解。此外，盡管在大量投入樣品的情況下機械裂解方法可能就足夠了，因此可以進行廣泛的大小選擇，但我們的方法可以優化DNA的高產量，并且在輸入樣品量有限的情況下非常有利。
我們用于堿基識別，組裝和環化的下游計算工作流程專為從納米孔或PacBio測序生成的易錯，長讀長測序數據而設計。由于納米孔測序會在均聚物區域產生較高的錯誤率，而PacBio測序具有較高但相對隨機的錯誤率，因此仍建議使用短讀長進行修正以進行插入缺失校正和高質量組裝。我們發現，當短讀長沒有均勻地覆蓋重疊群時，短讀長修正效果會受到影響(例如，在從不同的DNA提取物中產生短長的情況下，或在某些短讀長文庫制備方法中修飾有偏差的低GC區域時)。我們預計，隨著對長讀長測序技術和堿基識別(比如PacBio循環一致測序和神經網絡堿基識別)的未來改進，對短讀長進行額外修正的需求將變得不再那么緊要。
從糞便中提取DNA時，珠子敲打(球磨)是酶促裂解的最常見替代方法。實際上，這種機械裂解方法已被廣泛用于復雜基質中革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的裂解。盡管通過球磨獲得的DNA在很大程度上被剪切而無法產生較長的讀長，但隨后的嚴格的尺寸選擇步驟可以產生更高分子量的DNA。這種方法可能是有利的，因為球磨可以有效地溶解多種生物。然而，在球磨后獲得的DNA大多被剪切成非常小的尺寸，因此尺寸選擇后的DNA產量往往受到限制。這種低產量的問題可以通過對具有足夠生物量和數量的樣品進行多次平行提取來克服。使用球磨時，另一個需要考慮的因素是，大小選擇可能很少獲得更容易裂解且具有更短、更易剪切的DNA的生物。
DNA extraction
耗時8小時
1 盡可能地將冷凍的糞便樣本放在干冰上(以保持樣本完整性)，將樣本管放在試管架上，并使用活檢打孔器將150 mg的糞便等分試樣分配到2 ml微量離心管中。對于較低生物量的糞便樣品，請準備多達300 mg糞便的等分試樣。
！注意 所有樣品均應在知情同意下并按照相關準則獲得。
！注意
活檢打孔器是鋒利的物體，在準備等份試樣時很容易滑落。準備等分試樣時，請勿用手抓住樣品管。
2 將樣品懸浮于500 μl PBS中并渦旋3–4 s進行混合。向糞便懸浮液中加入5 μl Qiagen裂解酶溶液和10 μl MetaPolyzyme。輕微緩慢地顛倒六次進行混合。在37°C孵育混合物1小時。
3 在通風櫥中，加入12 μl的20％(wt/vol)SDS和500μl的苯酚/氯仿(pH 8)。在微量離心管中加入約100 μl的
phase-lock。或者，將約100 μl的phase-lock添加到微量離心管的內蓋中，而不是直接添加到離心管中以方便使用。
關鍵步驟 phase-lock的使用是可選的，但使下一步的移液更加容易。但是，使用比指定數量更多的phase-lock會對產量產生負面影響。
4 將試管放入多位置渦旋儀，并以最小速度渦旋5 s。在室溫（18–21°C）下以10,000g離心5分鐘。將水相倒入新的2 ml微量離心管中。
5 加入90 μl 3 M乙酸鈉和500 μl異丙醇。將試管緩慢顛倒3次以混勻。將混合物在室溫下孵育10分鐘。
6 在室溫下以10,000g的轉速將管旋轉10分鐘，確保鉸鏈面向外邊緣。要非常小心，不要破壞小顆粒沉淀，用P200移液器取出并丟棄上清液。用100 μl新鮮制備的80％(體積/體積)的乙醇洗滌沉淀兩次。
7 從基因組DNA緩沖液組(Qiagen)中加入1 ml緩沖液G2、4 μl RNase A(100 mg / ml)和25 μl蛋白酶K。將試管緩慢倒轉3次以混合。將混合物在56°C的加熱塊中孵育1小時。孵育30分鐘后，輕輕顛倒一次或兩次以除去沉淀。
見疑難解答
8 在56°C條件下，預熱每列來自基因組DNA緩沖液套裝(Qiagen)的緩沖液QF1 ml。
9 用來自基因組DNA緩沖液套裝（Qiagen）的1 ml緩沖液QBT平衡Genomic-tip 20 / G，并允許緩沖液通過重力流流入廢物儲存器。輕輕顛倒兩次樣品，然后將其涂在平衡的Genomic-tip上。允許通過重力流進入樹脂。用來自基因組DNA緩沖液套裝(Qiagen)的1 ml緩沖液QC洗滌Genomic-tip端3次。將Genomic-tip放在2 ml收集管上方。用1 ml預熱的緩沖液QF將基因組DNA洗脫到收集管中。
關鍵步驟
Genomic-tip不應該被強行壓入試管中。它必須位于廢物容器和收集管上方。如果沒有其他合適的設置，通常可以通過使用試管架和/或移液器吸頭盒來完成。
見疑難解答
10 加入700 μl(0.7體積)室溫下的異丙醇沉淀基因組DNA。輕輕顛倒試管以混合并在室溫下孵育10分鐘。
11 在室溫下以10,000g離心15分鐘。用P200移液器除去上清液，并用200 μl 80％（體積/體積）乙醇洗滌沉淀。用移液器除去80％的乙醇。
關鍵步驟
沉淀可能很小，可能會從管壁上脫落。不要試圖用移液器吸掉所有80％的乙醇，因為這可能會除去沉淀物。相反，要留下一小部分乙醇和沉淀物。
12 將試管蓋打開10–20分鐘，直到乙醇池中≤10μl，風干沉淀物和剩余的80％乙醇，但不要完全干燥沉淀物。輕輕地重懸于200 μl無核酸酶的水中。
暫停點
提取的DNA可以在4°C下保存幾個月。
13 按照“試劑設置”中的指定，在自定義緩沖液中準備磁珠。將0.8體積（160 μl）的定制磁珠懸浮液添加到試管中，輕彈以進行混合。在室溫下在Hula混合器中將試管孵育10分鐘。
關鍵步驟
每次定制緩沖液的制備，磁珠懸浮液與樣品的比率都會有所不同。用非貴重的樣品測試每種微珠制劑的選擇嚴格性，以確保正確選擇。
14 短暫地向下旋轉試管，然后將試管放在磁力架上以沉淀珠子。等待?3分鐘或直到溶液變得澄清為止。用P200移液器小心除去上清液。用200μl新鮮制備的80％乙醇（體積/體積）洗滌沉淀的珠子，然后用移液器吸去乙醇。再次重復洗滌步驟。從磁力架上取下試管，快速旋轉，將試管放回磁力架上，用移液管吸掉殘留的乙醇。風干珠粒30 s。
關鍵步驟
不要過度干燥珠子，因為這可能會對DNA的回收產生不利影響，并可能導至DNA與珠子不可逆地結合。
15 從磁力架上取下試管，然后將磁珠重懸于50 μl無核酸酶的水中。如果要進行快速測序文庫制備方案，請重新懸浮于15 μl無核酸酶的水中。將懸浮液在37°C下孵育10分鐘。在磁架上沉淀珠子約3分鐘或直到溶液變澄清為止，然后將洗脫液轉移到新的微量離心管中。
暫停點
提取的DNA可以在4°C下保存幾個月
16 使用Qubit定量DNA濃度。建議的最小濃度為20 ng / μl。
見疑難解答
17 通過使用nanodrop定量DNA純度。建議的純度為A260 / A230> 2，A260 / A280> 1.8。
見疑難解答
18 使用安捷倫TapeStation或類似產品量化DNA大小分布。建議的大小分布是主要峰均值> 15 kb，最小質量(<50熒光單位)<2.5 kb。
暫停點
提取的DNA可以在4°C下保存幾個月。
見疑難解答
耗時4天
關鍵
該方案用于文庫制備和隨后的Oxford Nanopore MinION測序。對于在其他Oxford Nanopore或PacBio平臺上進行測序，請遵循為這些平臺設計的方案。
19 按照牛津納米孔技術通過連接(SQK-109; https://community.nanoporetech.com/protocols/gDNA-sqk-lsk109/v/GDE_9063_v109_revT_14Aug2019)的為基因組DNA測序方法進行測序準備DNA。按照以下步驟修改說明。在適配器連接和清理步驟中，將連接反應在Hula混合器上孵育，以完成所有孵育步驟。用長片段緩沖液洗滌珠子以富集超過3 kb的片段。對于最后的洗脫溫育步驟，請在37°C而不是室溫下孵育。
20 將RevD R9.4 MinION流通池(或類似產品)加載到MinION測序設備中，檢查流通池質量，并按照連接基因組DNA中的說明加載制備的樣品。
見疑難解答
21 按照以下說明開始進行測序運行，并進行以下修改。將運行時間設置為96 h，因為在默認運行時間過去之后，流通池可能仍然有效。關閉動態堿基識別，因為堿基識別被集成到Lathe工作流程中(詳見下文)。將數據輸出路徑設置為具有≥500GB存儲空間的位置，可以選擇使用外部固態硬盤驅動器。
22 運行進行后且<10個孔仍然有效，請停止測序運行。
關鍵步驟
根據樣品純度和流通池中活性孔的原始數量，此步驟可能需要1-4天。對于下游裝配應用，我們建議生成6Gbp的長讀長數據。裝配的連續性將隨著覆蓋深度的增加而提高。
耗時5天
關鍵
由于堿基識別，組裝，修正和循環化是資源密集型過程，因此我們建議在高性能計算環境中執行所有計算分析。
23 安裝miniconda3 (https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html)，Snakemake和Singularity。從(https://github.com/bhattlab/lathe)復制Lathe GitHub存儲庫，并將config.yaml文件復制到工作目錄中。
24 按照所需的參數編輯config.yaml文件，如在Lathe GitHub存儲庫上所述的那樣。特別是，選擇Canu或Flye進行裝配，然后將Lathe配置為長讀長修正(默認)，通過進入短讀長的路徑來進行短讀長修正，通過使用polish_both參數進行長讀長和短讀長讀取的修正，或者通過使用skip_polishing參數不進行修正。
25 如Lathe GitHub存儲庫中所述，通過使用Snakemake運行Lathe流程。如果先前已經進行了堿基識別，則可以按照GitHub存儲庫中的指示，通過預加載最終的堿基識別FASTQ文件來繞過此步驟。
26 可以在示例子目錄的5.final文件夾中以FASTA格式找到組裝輸出。通過使用分箱工具（例如MetaBAT2或DAStool）對最終的Lathe組裝進行后處理。環狀基因組可以FASTA格式在3.circularization / 3.circular_sequences目錄中找到。
疑難解答建議見表1。
步驟1–18，DNA提取：8小時
步驟19–22，文庫制備和測序：≤4天
步驟23–26，宏基因組學組裝和后處理：5 天
該方法描述了從人類糞便樣品中提取、測序組裝和分箱高分子量DNA的具體實驗步驟；根據我們的經驗，我們發現此處描述的DNA提取方法可從最初投入的300-500 mg糞便中產生1-2μgDNA。該DNA的大小分布峰為15–50 kb，足以用于無需PCR擴增和隨后在Oxford Nanopore MinION測序儀上測序的文庫制備。我們發現這些方法能夠在MinION R9.4流通槽上生成6–30 Gbp的長讀長數據。根據我們的經驗，Lathe工作流程能夠從具有6 Gbp長讀長數據的復雜腸道宏基因組中產生至少一個環狀細菌基因組。但是，這些結果可能會因覆蓋率，腸道復雜性，DNA片段大小和細菌基因組結構而異。
Dylan G. Maghini, Eli L. Moss, Summer E. Vance & Ami S. Bhatt. (2021). Improved high-molecular-weight DNA extraction, nanopore sequencing and metagenomic assembly from the human gut microbiome. Nature Protocols 16, 458-471, doi: https://doi.org/10.1038/s41596-020-00424-x