| 實驗步驟 | 1. 蛋白質沉淀與變性
( 1 ) 用研缽和研槌在液氮中將植物材料研磨成細小的粉末（ 見注釋 4) 。
( 2 ) 將約 200 μl 粉末轉移到 2 ml 的離心管中，加入 1.8 ml 預冷的三氯乙酸-2ME-丙酮溶液（見注釋 5) ，混和后置于 -20°C 1 h。三氯乙酸和丙酮可以使蛋白質變性并沉淀 ，同時還可以使各種多酚氧化酶和其他氧化酶類失活，從而阻止因酚類被氧化為醒類而導致的蛋白質互相結合形成難溶的復合體。該方法同酚抽提法[ 7,8] —樣都能使蛋白酶失活[ 3] 。丙酮還可以溶解植物細胞內的各種色素、脂質以及萜類化合物。而 2ME 則可以阻止蛋白沉淀過程中二硫鍵的形成。
( 3 ) 10000 g 下冷凍離心機中離心 10 min。
2. 2ME-丙酮溶液清洗蛋白質樣品
( 1 ) 棄掉離心所得上清后用 1.8 ml 預冷的清洗液（見注釋 5 ) 懸浮沉淀。-20°C 靜置 1 h。清洗目的在于去除殘存的三氯乙酸，避免因為酸化作用而導致的蛋白質難以復性溶解。
( 2 ) 10000 g 下冷凍離心機中離心 15 min。
( 3 ) 棄掉上清液，重復清洗操作 2 次（見注釋 6)。
( 4 ) 將沉淀進行真空干燥 1 h ( 或 SpeedVac 中干燥 20~30 min) 以完全去除殘留的丙酮。
( 5 ) 稱量沉淀重量 （見注釋 7)。
3. 蛋白質的溶解
( 1 ) 溶解蛋白質樣品所需 UKS 或 R2D2 的量根據不同植物組織而定。例如，對于玉米和葡萄葉片的蛋白質樣品我們按 60 μl/mg 干粉的比例進行溶解，而對玉米粒的蛋白樣品則按 50 μl/mg 干粉的比例進行溶解。
( 2 ) 振蕩 1 min 即可重新溶解干粉樣品。此時，樣品中含有細胞碎片。
( 3 ) 10000 g 室溫下離心 15 min，收集上清于另一離心管中。
( 4 ) 再次離心 15 min，上清液即為所得蛋白質樣品，可以在 -50 或 -80°C 保存數月。
一般而言，用于懸浮和溶解蛋白質樣品的溶液中都含有離合劑、變性劑以及還原劑 [9] 。離合劑可以打斷蛋白質內部的非共價鍵，從而幫助蛋白質去折疊。最普遍使用的離合劑是尿素和硫脲。常常將兩者結合使用以提高對蛋白質的溶解效率。而在使用離合劑的同時，必須使用變性劑才能增加對蛋白質的溶解。CHAPS 是一種兼性離子變性劑 ，它和非離子變性劑 Triton X-100 具有相同的助溶能力，但是它能更有效地阻止蛋白質之間的相互作用。SB3-10 比 CHAPS 具有更強的助溶能力，但是它在尿素濃度較高的溶液中難以溶解。巰基還原劑（最常見的如 DTT ) 和氫化磷可以阻止二硫鍵的形成 。磷化氫比 DTT 具有更強的選擇性和更高的效率，它在酸性條件和 pH 大于 7.5 的環境下仍能保持還原能力。常常以 TCEP- HCl (triscarboxyethyl phosphine) 的形式保存 ，相比 TBP 的保存形式，該形式更穩定、難揮發、更容易溶于水。
在 R2D2 蛋白質溶解液適用于用 IPG 膠條進行等電聚焦，該溶液的配制結合使用尿素與硫脲（見注釋 2)、CHAPS 與 SB 3-10、DTT 與磷化氫。
UKS 溶液是早期在發現硫脲與兼性離子變性劑可以大大增加蛋白質的溶解前常常使用的一種蛋白質溶解液。該溶液含有較高濃度的尿素 （接近飽和，見注釋 2 ) ，使用的是 Triton X-100 而不是 CHAPS 和 SB 3-10。UKS 的特點在于含有離子變性劑 SDS，可以大大提髙蛋白質的溶解效率，抑制蛋白酶的活性[ 10] 。盡管作為離子變性劑 SDS 與等電聚焦緩沖系統不兼容，但是因為 Triton X-100 的存在能和 SDS 形成膠態離子，在電泳過程中移到陰極，故緩沖系統能夠容忍該濃度 SDS 的存在。UKS 也含有 K2CO3 可以使得緩沖系統堿性化，從而組織蛋白質與蛋白質以及蛋白質與核酸之間的互作，抑制蛋白酶活性。
R2D2 既可以用來溶解蛋白質樣品，也可以用來水化 IPG 膠條；而當使用 UKS 溶解的蛋白質樣品時，則必須使用另外一種 IPG 膠條水化液。兩種溶解液的蛋白質溶解能力大致相當，因此，建議只使用其中一種。如果制備的樣品中可能會有較多的蛋白酶時，推薦使用 UKS。向兩種溶液中加入兩性電解質可以提高等電聚焦電泳的分辨能力。
4. IEF 電泳前蛋白質樣品的準備
( 1 ) 蛋白質樣品在電泳前需要再次離心，去除沉淀。
( 2 ) 若采用硝酸銀染色法，每根膠條（24cm 長，自制膠或 IPG 膠條）的上樣量約為 50 μg 蛋白質（圖 1-1A 、B ) ; 若采用 CBB 染色法，則為 150~500 μg （圖 1-1C 、D) 。
( 3 ) 溶解在 R2D2 中的蛋白質樣品可以在用 R2D2 溶液補足體積至 450 μl 后直接用來水化 IPG 膠條[ 6] 。
溶解在 UKS 中的樣品可以直接用來進行傳統的等電聚焦電泳[ 3] 。若采用 IPG 膠條進行等電聚焦，則必須用另外配制的水化液（ 圖 1-1A 、B，見注釋 8 ) 補足體積至 450 μl 后進行水化。單獨配制的水化液含有硫脲、CHAPS 及三氫化磷，同時還可以降低 SDS 的濃度，提高分辨率。 展 |
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