上樣并進行DNA測序實驗

試劑、試劑盒 緩沖液和溶液0.5XTBE 和 或 1XTBE凝膠核酸和寡核苷酸

儀器、耗材 自動微量加液器牛頭夾凝膠溫度監測條巴斯德吸管帶塑料涂層的金屬板穩壓電源解剖刀片鯊魚齒梳注射器85°C 水浴和 100°C 烘箱

實驗步驟

材料

緩沖液和溶液

貯存液. 緩沖液和試劑的成分見附錄 1。

稀釋貯存液到合適的濃度。

0.5XTBE 和/或 1XTBE

凝膠

變性聚丙烯酰胺凝膠

已經在第 8、9、10 節中介紹過

核酸和寡核苷酸

DNA 測序反應

見方案 3~7 的闡述。

特殊設備

自動微量加液器（20ul)

微量加液器應該配備一套毛細吸管頭（如，Multi-Flex) 或其他的加樣設備（見測序膠加樣第 8 步內容)。

牛頭夾（5 cm 長，每塊膠 5~7 個）

凝膠溫度監測條

這些條是 TLC（thermochromic liquid crystal) 指示物，在電泳的過程中當凝膠的溫度升髙時它們會改變顏色。包括 BioWhittaker 在內的幾家商業公司出售溫度監測條。

巴斯德吸管

帶塑料涂層的金屬板

任選. 見步驟 2。

能供應大于 75W 的穩壓電源

帶有自動線路轉換的大多數電源都能提供穩定的電壓、功率或電流。一個配有多套輸出裝置的電源有在 7000V 輸出 300W 的穩定功率的能力，它能很容易同時地進行兩個或三個測序電泳。

帶可調換式刀片的解剖刀片

這刀片是用來從測序膠模上取下絕緣帶的，有時也用來從加樣板上刮下殘留的聚丙烯酰胺。

解剖刀片

許多型號的電泳儀上的槽都是通用的。盡管依據同樣的設計，但是生產商之間在玻璃板和墊片上的安排還是不同的。大部分商業設備運行的都比較好，生產商的選擇主要是個人的選擇。然而，作者建議最好購買帶固定金屬板的設備。這些金屬板一般是鋁制的，它們可通過凝膠表面把由電阻產生的熱量散布掉，從而阻止在凝膠的邊緣出現「笑臉（smiling）假象。

鯊魚齒梳（0.4 mm 厚，有 32，64 或 96 個齒，視電泳儀的要求而定）

在讓凝膠成型的過程中用同一個齒梳很必要的。

注射器（10cc) 和 22 號皮下針頭

85°C 水浴和 100°C 烘箱

當測序反應在微量滴定板上進行時水浴。而當反應在毛細管中進行吋要用烘箱。

方法

警告：在實際操作中很大的電壓施加在 DNA 鍘序膠上。過強的電流能引起嚴重的燒傷、心臟肌纖維震顫、呼吸中樞停止，窒息是由于呼吸肌的麻痹造成的。一定要確認：用于電泳的凝膠盒是絕緣的，所有緩沖液槽都蓋好了，凝膠被放在一個干燥穩定的實驗臺了。在加樣或取凝膠前都要關閉電源。

1. 用濕的紙巾或一塊濕的海綿把任何干的聚丙烯酰胺從膠模上擦去。用移液管吸幾毫升的 1XTBE 緩沖溶液沿較小的或有切口的玻璃板加入，一邊慢慢地從凝膠上移走梳子。用解剖刀片把絕緣膠帶切開，把它從膠模的底部剝去。不要從膠的邊緣把它移開。

2. 按照生產商的說明用牛頭夾把膠模固定在電泳儀上，用帶塑料涂層的實驗室用夾子或者用電泳儀固有的螺旋夾。一般較小的或者有切口的板應該和電泳儀直接接觸, 而較大的沒有槽的應直接對著觀察者。

在電泳期間如果電泳儀沒有金屬板散去電泳產生的熱量，就加一塊金屬板，比如一塊帶塑料涂層的鋁板，把它裁成和無槽玻璃板一樣的尺寸散熱效果就很好并且重量很輕。

3. 用合適的緩沖液把電泳儀的上下槽加滿。

對于標準或含有甲酰胺的凝膠

a. 用 1XTBE 添滿上下槽。下槽的緩沖液高度應剛好超過玻璃板的底部。上槽的緩沖液高度應剛好超過有切口比較小的板的上緣，并同膠直接接觸。

b. 用裝好 lxTBE 的 10 ml 注射器沖洗膠的頂部，以從膠上除去多余的聚丙烯酰胺和尿素。如果必要的話，用注射針把玻璃板上的所有聚丙烯酰胺碎片都刮掉。

用巴斯德吸管把附著在下槽玻璃板底的氣泡趕走。

c. 將電極與電泳裝置相連，然后供電。陰極（黑色）應連到上槽上，陽極（紅色）連底部，連上固有的溫度感受器（如有）或溫度監測條。在 50~70W 的恒定電壓下電泳約 45 min 或者直到膠的溫度達到 45~50°C 為止。切斷電源，拆開電極。

對電解質梯度凝膠

a. 上槽用 0.5XTBE 灌滿，下槽用由 2 倍體枳 1XTBE 加上 1 倍體積的醋酸鈉組成的混合溶液（見方案 10) 灌滿。

b. 用 0.5XTBE 沖洗，同上除去尿素/聚丙烯酰胺。不要預電泳電解質梯度凝膠。

4. 將含有測序反應物的毛細管放在 100°C 的烘箱里培養 2 min。如果反應在微量滴定板上已經完成就打開微世滴定板蓋，將無蓋的滴定板漂在 85°C 的水浴上溫浴 5 min。

5. 孵育滴定板的同時，在帶有 22 號針頭的 l0CC 注射器中吸滿 0.5X 或 1XTBE。用力推出一些 TBE 灑在浸沒在電泳液中用于加樣的膠面上，以便從加樣區除去任何殘留的尿素和聚丙烯酰胺碎片。繼續推出直到在加樣區看不到殘留尿素。

尿素從凝膠中快速擴散，將在孔和窄縫的底部形成墊。由于比測序反應更高的濃度. 尿素墊將取代孔底部的反應物。取代的結果是 DNA 片段不均的遷移到凝膠里并呈不規則的序列階梯。

6. 輕輕地把鯊魚齒梳插入（齒向下）加樣孔，把鯊魚齒梳向下推直到齒剛好穿透凝膠的表面。

7. 把細絲管或微量滴定板蓋從水浴或烘箱中移到冰中。在被加到凝膠上之前將樣品保持在 0°C。快速冷到低溫是為了延遲模板和放射性標記鏈之間的復性。

8. 從每種測序反應物中取 1~5ul(見方案 3~7 介紹的體積）加樣于凝膠上相鄰的槽中。

見測序凝膠加樣。

樣品將流入小孔在聚丙烯酰胺表面形成一條緊密的帶，記錄模板的順序并注意使每套樣品均按相同的次序加樣。

可以把一份舊的測序反應物加到凝膠邊緣額外的加樣槽里作為界限，以便準確無誤地分清最終放射自顯影片的左右方向。

9. 當所有的樣品都加完后，將電源和電極設備相連接：負極（黑）接上槽，陽極（紅)接下槽。凝膠電泳應在足夠恒定的功率下進行以維持 45~50°C 的溫度。

10. 依靠目的序列和寡核苷酸引物之間的距離，當第一次加樣的緩沖液中的溴酚藍遷移出標準或含甲酰胺的變性聚丙烯酰胺凝膠約 15 min 后（1.5~2.0h) 進行第二次加樣，再度將測序反應物加于凝膠之上。第一次加樣得到的序列離引物較遠，而第二次加樣得到的序列更為接近。用這種二次加樣的方法可以使可讀序列的長度擴展約 35%。

a. 關掉電源并把測序裝置和電源分開。

b. 移掉上下槽的電泳緩沖液。

c. 如上步驟 4 介紹的那樣將樣品熱變性。

d. 加樣。

e. 重新把測序裝置和電源連接。

f. 進行電泳，如前一樣，在足夠恒定的功率下保持溫度在 45~50°C。

作為一種選擇，在電泳進行的合適階段，通過用由 2 份 1XTBE 和 1 份 3mol/L 乙酸鈉組成的緩沖液取代下槽的電泳緩沖液可以擴大可讀序列的長度。

11. 在電泳的最后，按照在方案 12 介紹的步驟取下凝膠，進行放射自顯影。