上海生科院揭示細菌磷酸化利福平產生耐藥性的分子機制

　　3月21日，《美國科學院院刊》（PNAS）在線發表了中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態研究所張鵬研究組題為Structural basis of rifampin inactivation by rifampin phosphotransferase 的研究論文。該研究通過解析利福平磷酸轉移酶（Rifampin Phosphotransferase, RPH）不同構象的晶體結構，以及生理、生化分析，揭示了RPH磷酸化利福平及利福霉素類抗生素導致其失活的分子機制。

　　利福平（Rifampin, RIF）屬于利福霉素類抗生素，是目前治療結核病的一線藥物，并被廣泛應用于其他細菌感染的治療。長期大量使用利福平導致致病菌對其產生多種耐藥性，嚴重影響了結核等傳染病的防御和治療，而耐藥機理的研究對解決細菌耐藥性至關重要。RPH是一類導致細菌對利福霉素類抗生素產生耐受的抗性蛋白，其通過消耗ATP磷酸化利福平及利福霉素（C21位羥基），使其喪失抑菌活性。然而人們對RPH的催化機理卻不清楚。

　　在本項工作中，張鵬研究組的博士研究生齊曉峰等解析了致病菌Listeria monocytogenes來源的利福平磷酸轉移酶（LmRPH）催化過程不同底物結合狀態的晶體結構。通過結構比較、酶活測定、抑菌實驗、質譜分析等實驗手段，研究人員發現LmRPH由三個獨立的結構域組成：ATP結合結構域（ATP-binding domain, AD）、RIF結合結構域（RIF-binding domain, RD）和一個含有關鍵催化位點組氨酸的結構域（His-containing domain, HD）。AD上的ATP結合位點和RD上的RIF結合位點相距較遠（49?），HD可以在AD和RD之間擺動從而實現磷酸基團從ATP到RIF的傳遞。HD在此過程中穩定了AD對ATP的結合，并與RD共同形成RIF結合口袋。RIF的主要分子構架（安莎橋和萘酚環）通過疏水作用結合在LmRPH分子表面的結合口袋內，而其R基團游離在口袋外，這一發現解釋了為什么RPH對利福霉素家族其他成員同樣具有活性。RIF磷酸化位點附近的四個氨基酸His825, Arg666, Lys670和Gln337在催化過程發揮重要作用，其中來自HD的His825在ATP的存在下可被磷酸化，很可能在催化過程中負責磷酸基團的轉移。基于上述結果，研究人員提出了RPH催化利福霉素磷酸化的分子機理，而這一磷酸化很可能導致利福霉素對其靶點蛋白（細菌RNA聚合酶）的結合力降低從而喪失抑菌活性。該研究為新一代利福霉素類抗生素的研發指出了方向。

　　該研究得到了基金委、科技部和中國科學院的經費資助。晶體衍射數據收集工作得到了國家蛋白質中心（上海）設施19U線站和上海光源17U線站的支持與幫助。

（A）轉入LmRPH的大腸桿菌可耐受高濃度利福平；（B）LmRPH體外酶活分析；（C）RIF結合口袋；（D）催化位點（紅色示磷酸化的利福平）；（E）LmRPH催化利福霉素磷酸化的分子機制。