不同平臺的二代測序技術

　　二代測序技術基于大規模平行測序技術（massive parallel analysis，MPS），它能同時完成測序模板互補鏈的合成和序列數據的獲取。主要可以分成Roche 454焦磷酸測序、Illumina Solexa合成測序和ABI SOLiD連接法測序。

　　（1）Roche 454焦磷酸測序：使用邊合成邊測序技術，避免了Sanger法存在的宿主菌克隆問題。即首先將目的DNA片段打斷成300-800bp的小片段，然后在5’端加上一個磷酸基團，并將3’端變成平端，再在兩端加上銜接子組成目的DNA的樣品文庫。之后將目的DNA片段固定到磁珠上，將磁珠包被在單個油水混合小滴中進行獨立的擴增，從而實現所有目的DNA片段進行平行擴增PCR。隨后將這些DNA放入PCT反應板中共進行后繼測序，這里面包含了化學光反應所需的各種酶和底物。測序開始時，將T、A、G、C按順序循環單分子進入PTP 板，如果發生配對，則會釋放一個焦磷酸鹽分子，其在后續與ATP磷酸化酶和蟲熒光素反應產生光信號，此光信號被捕獲以確定堿基序列。

　　（2）Illumina Solexa合成測序：使用克隆單分子陣列技術。首先將目的DNA片段打斷成100-200bp，隨機連接到固相基質上，經過Bst 聚合酶延伸和甲酸胺變性的橋PCR循環，生成大量的 DNA簇，之后的反應與Sanger法類似，每次延伸所產生的光信號被標準的陣列光學檢測系統分析測序，下一次循環中把終止劑和熒光標記基團裂解掉，然后繼續延伸 dNTP，實現了邊合成邊測序技術。

　　（3）ABI SOLiD連接法測序：首先制備DNA文庫，可以使用片段文庫和配對末端文庫。第二階段與焦磷酸測序相同，加入磁珠等反應元件進行emPCR平行擴增，，不同的是該方法的磁珠只有1 μm。在連接測序中，底物是 8 個堿基的八聚體單鏈熒光探針，在5′末端分別標記了CY5、Teaxs Red、CY3、6-FAM這四種顏色的熒光染料。3′ 端的第 1、2 位堿基類別排序分別對應著一個固定的熒光染料，第 3、4、5 位堿基“n”是隨機堿基，第 6、7、8 位堿基“z”是可以和任何堿基配對的特殊堿基。一次測序中包括了五輪連接反應，可以減小測序誤差。

　　2.5代測序——半導體測序技術，由Ion Torrent研制開發。由于使用到了Emusion PCR技術，其實質介于二代和三代測序技術之間。該技術使用一種高密度半導體芯片，每個芯片單獨的進行測序。實驗時先將芯片置于一個離子敏感層和離子感受器之上，當DNA聚合酶在每一個單分子模板鏈上滑動時，發生聚合反應，釋放出氫離子，最終離子感受器就會捕捉到這種信號，從而讀出DNA序列。