圖1. 保留因子、拖尾因子、分離度及理論板數的計算。
幾乎每一個色譜工作者都做過液相方法開發的工作。不管你的工作是要對一個常規的方法進行偶爾的調整，進而建立一個一次性的方法來支持化學合成，還是需要采用一個成熟的方法來進行生產過程的檢測，對液相方法開發原則的深刻理解都是很有價值的。
根據經驗，“完美”的液相方法是不存在的，每一個方法都可以做得更好。“沒有最好，只有更好”只是方法開發的首要原則，要想讓方法做得更好一點，隨之花費的時間可能是分析人員所無法承受的，所以，開發一個適合于手邊工作的方法即可。
目標是什么？
很多色譜工作者在進行方法開發項目開始，心中沒有一個即使是模糊的目標，感覺工作最終是靠反復試驗完成的，而不斷試驗常常會以反復失敗結束，這樣浪費了寶貴的時間和金錢。但大部分人都沒有大量多余的時間，可以花費在探究導致偏離目標的可能性上，所以都需要一個目標，這個目標根據不同情況也有差異。如果想快速檢測合成產物的純度，那么通常30min梯度洗脫的方法就可以做這項工作，不需要投入再多。相反，如果你的方法是要對10000個臨床研究樣品進行技術支持的話，那么將運行時間從6min減少到4min會是你值得去做的事情。下面所列的是用在液相方法開發中的一些因素，希望可以幫助你確定目標：樣品數量；運行時間；被分析物數量；基質的數量；靈敏度；重復性；精密度和準確度；濃度范圍；定性和定量；儀器及操作限制；樣品制備要求；驗證要求。
當然，影響液相方法開發的因素有很多，沒有必要去詳細討論每一個因素，這里舉幾個例子。在溶出度試驗中，有兩個需要定量的活性成分，它們的濃度為mg/ml，如果通過觀察穩定性指示的檢測或雜質分布圖進行，其中破壞性降解的樣品能產生5~30個峰，其中一些峰面積可以是主成分色譜峰面積的0.05%~0.1%。在后一種情況中，分離會比前者更具挑戰性，所以你可以以一個有更強分辨率的試驗性方案開始。但將能想到的很多方法特征列出來確是一個不錯的想法。如果一個新的方法是對以前方法的修飾或與其它方法相似，你可以采用現有方法中的性能指標作為方法開發的起點。
方法完成的確定
你需要有一種方式來量度方法開發的終點，以便不會落入“只是多一次實驗”的陷阱，使方法開發的過程沒有必要的延長。你需要一些定量指標來量化所開發的可以應用的方法，方式之一是遵循管理機構的建議。例如，美國食品藥品管理局藥物評價與研究中心（FDA-CDER）出版的“指導原則”可有計劃地去幫助他們的職員依據法規審查色譜方法的性能。其中之一就是色譜方法的驗證的指導原則 。這不是一個法律或政策，但它給予了我們一個好的概念，即檢查員將查看方法的哪些方面。四個定量的標準即為保留因子k（在文件中為容量因子k'），拖尾因子Tf （文件中為T），分離度Rs，理論板數N，這些都是非常好的評價任何分離效果的指標，同時也是建立用于在運行批樣品測試方法之前的系統適用性試驗的核心指標。
K=（tR-t0）/t0 ［1］
保留因子是衡量樣品在固定相和流動相之間分配的指標，但是從實際經驗來看是用其它方式來衡量保留行為。
其中tR及t0相應為保留時間及死時間。如圖1所示，死時間常常以不保留化合物進樣或以基線的最先波動來判定，通常認為是溶劑峰。保留時間是指進樣直峰最大的時間，理論上說，對于最好的色譜性能，所有色譜峰能在2<k<10時被洗脫出來，但1<k<20也是可接受的范圍，尤其是對于復雜的樣品。在k<2時，對于大多數色譜圖，色譜峰將會在無保留t0時被沖洗出來，并且保留時間會因流動相組份的微小變化的改變比k>2時更敏感。FDA推薦k>2，在圖1中，t0=1.00 min，tR1=3.00min，tR2= 3.40min，所以 k1=（3.00-1.00）/1.00 =2.00，k2=2.4。
拖尾因子有時以對稱性因子來表示，衡量色譜峰的前沿或拖尾。
Tf=（a+b）/2a [2]
其中a 和 b如圖1所示，從色譜峰的頂點劃一條垂直于5%峰高處的直線，其交點到峰前后的距離分別為a 和 b。FDA推薦Tf<2，但如果Tf ≤1.5，則色譜峰型更為好看，條件更好小峰更易與主峰分離。對于圖1中，色譜峰2，a=0.10 min，b=0.16 min，故Tf=（0.10+0.16）/（2×0.10） =1.30。
分離度表示了兩個色譜峰在色譜圖中的分離情況，其中t1和t2相應為色譜峰1和色譜峰2的保留時間，w1和w2為色譜峰1及2的峰寬，可由測量峰拐點處的切線與基線交點間的距離得到。測量基線峰寬不太方便，特別是如果噪音或基線漂移或者色譜峰不能完全分離的時候。多數人喜歡以測量半峰高處的峰寬即w0.5來代替峰寬，如圖1 所示，因為更方便且不易出錯。那么，公式3 變為公式4。
Rs=（t2-t1）/0.5（w1+w2） [3]
Rs=（t2-t1）/1.7×0.5（w0.5,1+w0.5,2） [4]
對于峰型很好的色譜峰來說，達到基線分離Rs=1.5，但當出現峰拖尾等情況時，這也不能保證兩峰完全分離，FDA推薦Rs> 2。如圖1所示，w0.5,1=0.112min，w0.5,2=0.126min，所以 Rs=（3.40-3.00）/1.7 × 0.5（0.112 + 0.126） = 1.98。
理論板數（也稱柱效）是衡量柱效的指標，理論板數主要受填料的粒度（粒度越小N值越大）及柱長（色譜柱越長，N值越大），以及流速、溫度、流動相組成、樣品分子量等影響。理論板數按下式計算：
N=16（tR/w）2 [5]
如測量分離度中的峰寬一樣，半峰高處的峰寬比較容易測量，所以大多數色譜工作者喜歡用下式計算。
N=5.54（tR/w0.5）2 ［6］
一個新的150mm ，填料粒徑為5μm或100mm，填料粒徑為3μm的色譜柱，如用一個適合的化合物來測試的話，其柱效會有N = 12000或者更高，但在實際樣品測定時，多為N=10000。
FDA推薦N>2000，這個柱效在一個50mm，5μm不是很好性能的色譜柱上即可得到。所以，我認為這個指標不太值得用于評估色譜柱的好壞。對于圖1中，色譜峰1，N=5.54（3.00/0.112）2=3975，有一點要記住，公式5和公式6均為等度洗脫時的情形，對于梯度洗脫，則不適用。
上面已經將方法建立所需的元素羅列出來，也已經有了定性及定量的 （Rs、k、運行時間等）指標來判斷方法是否滿意。