圖2. 3個癌癥組和正常組受試者血清多肽表達譜數據選擇和比較分析。 (A) 各個癌癥組分別與對照組進行Mann-Whitney U檢驗。只有校正P值小于0.00001的峰才能進入第二次篩選（峰強度中位數值> 500單位）：如果可以通過1個癌癥組或對照組的閾值，則此峰入選。(B) Venn圖顯示一個癌癥組中強度升高或降低的多肽的總數目。(C) 3個癌癥組和對照組選定特征的熱圖的多元或二元比較。柱表示每組樣品數；橫排為m/z峰（非以數字表示）。二元比較中所用的肽段為各組中特別升高或降低者：多元熱圖包含有組合的、不可歸還的多肽數目。多級膀胱癌和乳腺癌熱圖的比例尺為標準化的強度，范圍為從0（綠色）到500（紅色），中點為250（黃色）；前列腺癌的熱圖為從0（綠色）到2000（紅色），中點為1000（黃色）。
為達到這一目的，我們利用了目視檢測光譜重疊、肽離子相對強度比較和統計分析，對106例晚期前列腺癌、膀胱癌和乳腺癌以及健康人的血清樣本測得的精確的肽表達模式的數百種特征性參數進行分類，以尋找最具有預測性的幾種關鍵性多肽。我們發現，將關鍵性多肽的范圍大大縮小至易于識別的少數（如僅限于特征肽段）后，并未對分級預測產生不利影響。MS或基于MS的序列識別技術識別的61種特征性肽段，均為血液中高豐度蛋白的降解產物或相關產物。通過分析疾病與蛋白水解模式的關系，我們發現，胞外蛋白酶的活性與體內蛋白質結合及補體降解途徑一起，不僅對癌癥特異性多肽的產生有影響，還影響到癌癥類型特異性血清肽段的產生。
結果
對基于MS的血清樣本中651個肽離子信號的無監督分析，可區分三類癌癥和正常對照
我們分析了本研究所采用單標準臨床規范收集到的73例癌癥患者（其中晚期前列腺癌32例，乳腺癌21例，膀胱癌20例）及33例正常志愿者的血清樣本[29]。年齡分布、性別及臨床特征見補充表1（本文章的補充資料可在線查閱doi:10.1172/JCI26022DS1)。 收集到的樣品采用統一方案處理，包括2次凍融后進行初次保存，隨后抽樣進行蛋白質提取和MS分析[29]。全部106個血清標本作為同一批樣本，利用專門的樣品處理系統進行全自動處理（包括采用包被C8的磁珠進行肽段提取，洗滌，洗脫，與基質混勻，上于MALDI靶板）后， 在1小時內進行MALDI-TOF MS自動分析（參見補充方法）。在同日內按照以往報告方法進行分析、計算機校準和目視檢測12個參考樣本/譜，以驗證系統的重復性和再現性（參見補充方法）[18,29]。在隨后的處理和分析過程中，將取自不同癌癥患者和正常人的血清標本進行隨機分配，采用專用的entropycal程序將處理后的質譜圖對齊后[29]，在700–15,000 Da的范圍內共獲得651個不同的質量與電荷比值（m/z值）。對每個標本的651個峰強度進行標準化（信號強度減去本底，除以相應譜的總離子流，再乘以換算系數107)后，逐個進行無監督的平均-連鎖系統聚類分析。二元和多元比較結果表明，患者與正常人及不同類型的實體瘤之間，肽段表達模式迥然不同（見圖1）。
圖3. 3個癌癥組和正常組受試者血清肽表達譜選定峰的MALDI-TOF質譜圖重疊。譜圖按照方法部分所述獲得后，進行匹配和標準化，以質譜圖瀏覽器顯示。除2021.05（為大量的無組間差異的肽離子的代表）外，選定可代表組間差異的肽離子的標準化強度。24處重疊區各代表一個癌癥組與對照組的譜圖的二元比較結果（膀胱癌：n = 20， 綠色；前列腺癌：n = 32; 藍色；乳腺癌：n = 21; 紅色；對照組：n = 33; 黃色)。其排列方式允許經標準化后換算成同樣大小的3個二元比較結果可在同樣的質量范圍窗內顯示，各肽離子峰顯示的均為單同位素峰。