在氧供給充足的條件下，脂肪酸可在體內分解成二氧化碳和水，釋出大量能量。除腦組織和成熟紅細胞外，大多數組織均能氧化脂肪酸，但以肝及肌肉組織最活躍。
1．脂肪酸的活化——脂酰CoA的生成
脂肪酸的活化反應在胞液中進行，脂肪酸在脂酰CoA合成酶（acyl-CoA synthetase）催化下，在ATP、CoA-SH、Mg存在的條件下，活化為脂酰CoA。脂酰CoA含有高能硫酯鍵，而且水溶性增大，使脂酰基的代謝活性明顯增加。分子中的CoA是脂酰基的載體。由于反應過程中生成的焦磷酸（PPi），迅速被細胞內的焦磷酸酶水解，阻止了逆向反應的發生，因此1分子脂肪酸活化成脂酰CoA，實際上消耗了2個高能磷酸鍵。
2.脂酰CoA進入線粒體
脂肪酸的活化在胞液中進行，而催化脂肪酸氧化分解的酶系存在于線粒體基質，因此活化的脂酰CoA必須進入線粒體才能分解。脂酰CoA不能直接透過線粒體內膜，其脂酰基需經肉毒堿（carnitine即3－羥－4－三甲氨基丁酸）轉運才能進入基質。線粒體內膜的兩側存在著肉毒堿脂酰轉移酶Ⅰ及Ⅱ，在位于線粒體內膜外側面的酶Ⅰ的催化下，脂酰CoA轉化為脂肪酰肉毒堿，而移到膜內側，進入膜內側的脂肪酰肉毒堿又經酶Ⅱ的催化而重新轉變成脂酰CoA，并釋放出肉毒堿。肉毒堿脂酰轉移酶Ⅰ是限速酶，脂酰CoA進入線粒體是脂肪酸氧化的限速步驟，當饑餓、高脂低糖膳食或糖尿病時，體內糖利用發生障礙，需要脂肪酸供能，這時肉毒堿脂酰轉移酶Ⅰ活性增加，脂肪酸氧化增強。
3.脂酰基的β-氧化
脂酰基進入線粒體基質后，從脂酰基的β-碳原子開始，經過脫氫、加水、再脫氫及硫解四步連續的反應，脂酰基斷裂產生1分子乙酰CoA和1分子比原來少兩個碳原子的脂酰CoA。催化這些反應的酶彼此結合形成多酶復合體，稱脂肪酸氧化酶系。
（1）脫氫：脂酰CoA在脂酰CoA脫氫酶的催化下，α、β碳原子各脫去一個氫原子，生成α，β-烯脂酰CoA，脫下的2H由FAD接受生成FADH2。一分子FADH2進入呼吸鏈通過氧化磷酸化產生1.5分子ATP（過去的理論值為2分子ATP，詳見氧化磷酸化一節）。
（2）加水：在水化酶催化下，烯脂酰CoA加水生成β-羥脂酰CoA。
（3）再脫氫：在β-羥脂酰CoA脫氫酶催化下，β-羥脂酰CoA脫下2H，生成β-酮脂酰CoA，脫下的2H由NAD接受，生成NADH+H。一分子NADH+H進入呼吸鏈通過氧化磷酸化產生2.5分子ATP（過去的理論值為3分子ATP）。
（4）硫解（加CoASH分解）：β-酮脂酰CoA在硫解酶的催化下，加入CoASH使α、β碳原子之間化學鍵斷裂，生成1分子乙酰CoA和1分子比原來少兩個碳原子的脂酰CoA。
以上生成的比原來少2個碳原子的脂酰CoA可再進行脫氫、加水、再脫氫及硫解反應，如此反復進行，直至最后生成丁酰CoA，后者再進行一次β-氧化，即完成脂肪酸的β-氧化。
4．乙酰CoA的去路：脂肪酸β-氧化的終產物是乙酰CoA，其進一步的代謝變化可進入三羧酸循環徹底氧化為二氧化碳和水，也可轉變為其它物質。
5.脂肪酸徹底氧化時能量的釋放和利用
脂肪酸氧化是體內能量的重要來源。以16個碳原子的軟脂酸為例：一分子軟脂酰CoA需經7次β-氧化，生成8分子乙酰CoA。因此1分子軟脂酸徹底氧化共生成（7×1.5）+（7×2.5）+（8×10）=108分子ATP。減去軟脂酸活化時消耗的兩個高能磷酸鍵，凈生成106分子ATP。