番茄子葉細胞核的分離提取為例子進行實驗
步驟2～7須在4℃下使用高壓滅菌過的設備進行。
1．將番茄種子種在滅菌的水飽和濾紙上，置于小盆內，用薄膜封口后，培養7天。用刀片切下番茄子葉后收集備用。
2．將40～50g新鮮組織放入300ml勻漿緩沖液，用韋林氏攪切器先1×4秒而后6×1秒。
3．過濾勻漿混合液，使其透過漏斗上的4層厚紗布及紗布下按孔徑遞減次序放置的3層Nitex尼龍篩網（300μm，100μm，52μm），匯入大燒杯中。全部勻漿物均濾完后把紗布集中在一起，將紗布上的濾液壓入尼龍網，并使其經漏斗流入燒杯中。切勿將濾液壓出尼龍網，亦不可使用抽濾，讓濾液靠重力作用下流。
4．將每批濾出的勻漿倒入500ml離心瓶中，用Sorvall GS－3轉頭5000r/min（4225g），4℃離心20分鐘。
5．吸去上清，然后將核粗提沉淀物用大口徑塑料巴斯德吸管溫和地反復吹吸，使沉淀懸浮于勻漿緩沖液中。將重懸起的沉淀轉入50ml離心管中，用勻漿緩沖液調節體積至約40ml。
6．4℃用Sorvall SS－34轉頭4000r/min（1912g）離心10分鐘，再次沉淀細胞核。重復步驟5和6三次，分別在3500r/min離心10分鐘，8分鐘和6分鐘。最后一次離心后，盡可能洗凈勻漿緩沖液。
7．將核懸浮于核懸浮緩沖液中，按每50g植物組織加0.5ml核懸浮緩沖液。用液氮冷凍，保存于－80℃。若核蛋白抽提即將進行，可不必將核冷凍起來。
核抽提物的制備 1．將細胞核置于冰上解凍，精確測定核懸浮液的體積。 2．加入核裂解緩沖液，使NaCl終濃度為0.47 mol/L（即，每毫升核懸浮加入182μl核裂解液）。 3．將核懸浮液置于搖床上，4℃溫和搖動30分鐘。 4．4℃微量離心20分鐘沉淀染色質。 5．小心移出上清，避免攪起膠狀的含DNA的沉淀，以使抽提液中避免含有此類雜質。 6．4℃透析上清3～4小時，中間換幾次透析液。 7．將透析液用液氮冷凍，再置于冰上解凍，4℃微量離心或用Sorvall SS－34轉頭10 000r/min（12 000g）離心15分鐘，棄沉淀，保留上清。此步驟是為了將其余可能在濃縮步驟中阻塞微量濃縮器的蛋白質沉淀除去。 8．用CENTRICONTM10微量濃縮器濃縮上清，以使提取液中蛋白質的終濃度為1～3mg/ml。可以溶菌酶為標準物用Bio-Rad Bradford-based蛋白質分析試劑盒來測定蛋白質濃度。經驗表明，要達到上述濃度，至少需要濃縮2～3次。 9．留出待作遷移分析的核抽提物，將剩余部分用液氮或干冰冷凍，貯于－80℃備用。 DNA片段的標記 l 聚丙烯酰胺凝膠的制備 1．安裝凝膠裝置并洗凈玻璃板。 2．配制4％丙稀酰胺凝膠液，將以下成分混合： 丙稀酰胺/雙丙稀酰胺（29：1） 4ml TBE（10×） 3ml APS（10％） 200μl TEMED 40μl 制備厚1mm的凝膠，并保證上樣孔可容納25μl樣品。凝膠聚合約需1小時，制好后，使用前可于室溫放置1天。 l 探針的標記 1．按下表順序將下列試劑加入1.5ml微量離心管中： EcoR I酶解的質粒DNA（1μg或約800fmol末端） 2.5μl Sequerase?緩沖液（5×） 2.0μl [α-32P]dATP（6000 Ci/mmol） 3.0μl 二硫蘇糖醇（0.1mol/L） 1.0μl 雙蒸去離子水（ddH2O） 0.5μl Sequerase?酶（用4倍Sequerase?稀釋緩沖液稀釋） 1.0μl 總體積： 10μl 2．室溫放置15分鐘。 3．加入0.5μl dNTP混合物，充分混勻。 4．室溫放置15分鐘。 5．加入90μl 0.35mol/L的乙酸鈉并充分吹吸混勻以終止反應。 l 測定摻入的放射性活度 1．取5μl標記反應混合物移至一新管中。將2μl此混合物點加到DE81濾膜上，再將該濾膜浸入盛有約20ml 0.5mol/L磷酸鈉（pH7.0）的燒杯中。再取第二張濾膜重復上述操作。 2．將燒杯置于平面振蕩器上，使溶液溫和振蕩5分鐘，將緩沖液倒入放射性廢棄物中。 3．用新緩沖液重復兩次清洗步驟。 4．用雙蒸水漂洗濾膜5分鐘，再用雙蒸水重復漂洗兩次。 5．用95％乙醇洗濾膜5分鐘。 6．使濾膜完全干燥，再將每一張濾膜移入閃爍計數管，加入閃爍混合物，計數。 7．計算理論摻入的最大比率。計算方法如下：1）每個反應可標記400fmol質粒DNA。2）標記反應在EcoR I酶切的質粒DNA兩端進行，每個末端可摻入兩個脫氧腺苷磷酸殘基。3）因此，每400fmol質粒DNA可結合1600fmol標記核苷酸。4）標記核苷酸的比活性是6000 Ci/mmol，即13 000cpm/fmol。5）因此，理論最大摻入值為每400fmol質粒DNA 13 000cpm×1600fmol＝2.08×107cpm或每400fmol片段1.04×107cpm。注意，僅摻入量的一半包含在待測片段中。隨后的酶解反應會釋放出一端標記的待測DNA片段和一端標記的載體DNA。 l 標記探針的分離 1．加95μl酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）于剩余的95μl標記混合物中。充分混勻。 2．室溫離心3～5分鐘以分離酚相與水相。 3．小心取85μl上層水相于另一干凈離心管中，將盛有酚相的離心管棄入放射性廢棄物中。加入200μl 95％乙醇于水相中，旋緊管蓋后，渦旋混勻。 4．將離心管于碎干冰上放置15～20分鐘，然后離心20分鐘。 5．用移液器，小心將含乙醇的上清棄于放射性廢棄物中。加入600μl 80％乙醇洗滌沉淀，離心1～2分鐘，用移液器棄去乙醇。 6．用真空離心蒸發濃縮器干燥沉淀2～3分鐘。 7．將沉淀用20μl 1×Sequenase?緩沖液重懸，再加入0.5μl 10units/μl的Pst I將標記的DNA片段從載體DNA上切下。37℃溫育30～60分鐘。 8．加入2.5μl高EDTA 10×凝膠染液于酶解混合物中。向先制好4％丙稀酰胺凝膠中上樣，然后用1×TBE緩沖液在大約10V/cm電壓下電泳約2.5小時。電泳時間取決于標記片段的大小。目的是為了很好地分離標記片段與質粒載體，但切勿使目的片段跑出膠外。 9．電泳后，小心地把凝膠用保險膜包裹好，對X光片曝光5～10分鐘。使用Sharpie?或其他防水標記物標記膠片及凝膠邊緣，以便膠片顯像之后可根據標記使凝膠與膠片重合。 10． 切下凝膠上對應地標記DNA的條帶，置于1.5ml離心管中。4℃下用300μl洗脫緩沖液溫育凝膠薄片過夜，以洗脫DNA。將洗緩沖液移取至另一干凈的離心管中。再向凝膠管中加入250μl洗脫緩沖液。－80℃冷凍再解凍，然后將洗脫緩沖液取出與前一次洗脫的溶液合并。將合并后的洗脫液離心10分鐘以沉淀聚丙稀酰胺的小碎片。移取上清至另一干凈離心管中，用2倍體積的95％乙醇沉淀DNA，碎干冰上放置20分鐘，然后離心20分鐘。棄上清，用約500μl 80％乙醇洗沉淀。用真空離心蒸發濃縮器干燥沉淀2～3分鐘。 11． 將純化的DNA片段重懸于20μl片段重懸緩沖液中。取一小等份計數測定回收的片段fmol數。一般情況下，大約可以回收原初標記量的50％。從凝膠中洗脫的效率大約為80％，但是收率會因DNA片段的大小而異。純化的DNA片段可在4℃最多可以保存2個星期。 遷移率變動分析法 l 聚丙烯酰胺凝膠的制備 1．組裝電泳裝置并洗凈玻璃板。 2．按下表配制4％非變性丙稀酰按凝膠溶液： 丙稀酰按/雙丙稀酰按（29：1） 4ml TBE（10×） 3ml APS（10％） 200μl TEMED 40μl 可灌制成1～1.5mm厚的凝膠。凝膠聚合約需1小時，使用前可于室溫下保存1天。 l DNA－蛋白質結合反應 1．將10mg/ml的poly(dI-dC)?poly(dI-dC)貯液用無菌雙蒸餾水稀釋成終濃度6μg/μl。將6μg/μl的poly(dI-dC)?poly(dI-dC)溶液與32mmol/L（pH8.0）的EDTA等體積混合，配制成工作溶液。用片段重懸緩沖液將32P標記的DNA片段稀釋至終濃度2fmol/μl。 2．對于標準DNA-蛋白質結合反應，按下表順序將下列試劑加入1.5ml微量離心管： 32P-標記DNA片段（2fmol/μl） &