與Sanger測序齊名的另一種測序技術為何消失？

　　在20世紀70年代中期，兩種直接測序DNA的技術被開發出來，其中一種是廣為人知且沿用至今的Sanger雙脫氧鏈終止方法，另一種是現在幾乎被人遺忘的化學測序方法，Maxam–Gilbert測序。

　　這種測序方法是由美國哈佛大學的Walter Gilbert和他的學生Allan Maxam開發的。1980年，Frederik Sanger和Walter Gilbert因“在測定核酸堿基序列上的突出貢獻”而分享了當年的諾貝爾化學獎。

　　事實上，Maxam–Gilbert方法一開始比Sanger測序更為流行，因為它可以測序雙鏈DNA，而Sanger技術需要克隆后產生單鏈DNA。不過，隨著新技術的出現，Maxam–Gilbert方法逐漸消失。

　　如何誕生

　　Gilbert曾經是一名物理學家，當他遇見James Watson后，開始對分子生物學感興趣。Gilbert知道DNA序列攜帶了生命的密碼，是從父母傳遞給后代，但在當時，人們根本不知道DNA序列是什么。

　　在60年代，Gilbert和他的同事完成了分離lac阻遏物的研究，這種蛋白質與DNA的特定區域結合。然后，他們嘗試分離這段DNA區域。當蛋白與特定區域結合時，他們利用DNase酶來消化DNA的其他部分。lac阻遏物的結合保護了這一區域，使得他們成功分離。

　　不過，他們發現DNA測序方法的開發既困難，又費力。他們試圖將DNA片段復制到RNA中，并設法通過酶分解以及電泳分離來測定RNA序列。這種方法似乎有效，不過極其慢，花了兩年才確定24個DNA堿基，大約每個月一個堿基。

　　之后，一名俄羅斯人拜訪了Gilbert，嘗試說服他做一項實驗：通過化學試劑來修飾與lac阻遏物結合的DNA。如果他們能夠將DNA上的鳥嘌呤（G）甲基化，那么就有可能區分每個堿基。Gilbert認為這是一項艱巨的任務，前景渺茫。不過，半年后俄羅斯人又來了。

　　他們嘗試用限制性內切酶來切割DNA，獲得長度大約在100 bp的片段，然后在DNA片段的一端加上放射性標記。G的甲基化會影響它，使得DNA在這個點斷裂。

　　“這無疑是一種測序方法。唯一的問題是你是否能夠通過觀察A和G來測序DNA？”Gilbert評論道。于是，他們又開始尋找化學試劑，來選擇性地處理C或T。

　　Maxam–Gilbert方法最終于1975/76年誕生，那篇詳細介紹它的文章于1977年發表在《美國科學院院刊》（PNAS）上。Gilbert的學生最終成功測序了長達5000 bp的質粒。

　　如何測序

　　Maxam–Gilbert測序方法的第一步是將選定的DNA片段變性成為單鏈，然后用放射性的磷32標記，通常在5’端。第二步是切割DNA鏈，利用哌啶和硫酸二甲酯來選擇性攻擊嘌呤堿基，利用聯氨（肼）來選擇性攻擊嘧啶堿基。

　　通過使用不同的試劑組合，你可以選擇性地切割DNA，讓它在指定的地方斷裂，比如C；C+G；G或G+A。將DNA樣品上樣到帶有不同試劑的試管中，將產生不同的DNA片段。之后將這些片段上樣到聚丙烯酰胺凝膠中，通過電泳區分DNA片段的大小。

　　在讀取序列時，你需要從凝膠底部的小片段開始，然后依次推進。如果條帶出現在G反應和G+A反應的泳道，那么這個堿基就是G。類似地，如果條帶僅僅出現在G+A的泳道，那么它就是A。這個過程也同樣適用于C和C+G泳道。

　　如何消失

　　盡管Maxam–Gilbert方法一度成為最流行的測序方法，但最終還是消失了，這其中有幾個原因。首先，它相當耗時。整個過程涉及到多個步驟，它們本身都很耗時。其次，步驟越多意味著犯錯的機會越大。如果出現錯誤，結果無法重復，那么錯誤排查也是一個大問題，需要花不少時間。

　　這種方法需要花幾天的時間才能確認200-300個堿基，因此在規模放大時也遇到困難。考慮到人類基因組包含30億對堿基，Maxam–Gilbert方法的消失也就不難理解了。就健康和安全而言，它也不是最佳的選擇。需要用到大量的放射性物質，以及聯氨這種已知的神經毒素。

　　相對而言，Sanger測序要簡單一些。同時，其他技術也在快速發展。這一切使得Maxam–Gilbert化學測序方法最終失去了吸引力。到了20世紀80年代，Sanger測序成為人們的新寵。

　　Gilbert在開發測序方法時并沒有預料到DNA測序終有一天將被用于全基因組的測序，直到1985年他應邀參加一個會議。

　　“我參加了那次會議，認為這是我聽到的最愚蠢的事情。這比我們現在測序的東西要大得多。不過在會議上，考慮到技術所處的位置，我意識到還是有可能測序基因組的，然后我成了基因組測序理念的倡導者，”Gilbert說。

　　“在我開始測序時，每個月測一個堿基，如今是一個下午測數十億個堿基。作為整個過程的參與者，我也覺得這不可思議。”

　　正如科學研究的各個分支一樣，理論和技術的進化都是不可避免的。現在流行的技術，也許十年后已無人提及。不過，對于這種經典方法的消失，大家難免還是有一些失落和不舍。