專家指南：如何研究基因調控（三）

　　Q5：在定位蛋白-DNA相互作用時，為降低DNA污染和片段化所引起的假陽性，同時也避免太嚴格的數據過濾所引起的假陰性，您的主要方法是什么?

　　Marc Facciotti(加州大學戴維斯分校)：

　　首先，從微生物的角度來看，我們選擇對天然表達的轉錄因子開展ChIP實驗。我們認為，這能夠將與過表達質粒相關的假陽性降至最低。第二，我們不會完全相信任何自動化的峰檢測算法。我們的策略是建立我們自己的自動化峰檢測工具，它讓假陰性降至最低，代價是一些假陽性峰也會被報告。隨后，我們手動組織峰列表，避免明顯的假陽性。這聽上去似乎很耗時，但對于小的微生物基因組并非如此。與后面追蹤和驗證假線索所浪費的時間和頭痛相比，前面花費的時間是值得的。

　　Kun Huang(俄亥俄州立大學)：

　　根據我的經驗，關鍵是樣品/文庫制備步驟，我們與生物學家密切合作，以了解QC過程。根據我們對多個實驗的觀察，交聯和超聲處理步驟很關鍵，但沒有得到足夠的重視。與ChIP-PCR或ChIP-chip等方法不同，其中的污染或“壞”片段不會被擴增或測定，ChIP-seq將受到這些步驟的嚴重影響。因此在測序之前需要小心控制片段大小。

　　對于文庫中已經被測序的潛在污染，污染來源(如病毒)常常有著小的基因組，傾向于高度擴增。因此必須從原始數據中去除過度重復的序列。此外，有時候它們無法定位到參考基因組，因此明顯降低定位率。在某些情況下，通過Blast高度重復的序列，我們可檢測污染的來源。

　　Jason Lieb(北卡羅來納大學教堂山分校)：

　　免疫沉淀應當在封閉試劑(如BSA)存在時用經過驗證的抗體來開展。最近Frank Pugh實驗室開發出一種新技術ChIP-exo，無疑將提高信噪比。

　　Xiaole Shirley Liu(Dana-Farber 癌癥研究所)：

　　在研究蛋白-DNA相互作用時，ChIP-seq是最好的方法。DNA污染不是個大問題，但抗體質量會大大影響最終的數據質量和噪音水平。片段化(如超聲條件)也有影響。抗體的質量控制、一致的步驟和生物學重復是確保數據質量的最好方法。分析方法也很重要。峰檢出程序(如MACS)提供了每個的 ChIP-seq檢出峰的倍數變化、p值和FDR。

　　Jun Song(加州大學舊金山分校)：

　　我們使用對照DNA的測序數據，以便對細胞類型特異的背景噪音和偏向進行建模。我們還通過分離基因組區域，開展多個樣品的標準化，這些區域包含來自背景區域的生物學信號。我們使用不同的回歸模型和隨機過程的思路，過濾掉偏向和假象。

　　Q6：在ChIP-seq/ChIP-chip數據分析時，您首選的計算工具是什么?

　　Marc Facciotti(加州大學戴維斯分校)：

　　我不能說哪個最喜歡。我們建立了內部的峰檢測軟件，它能夠處理一些古怪的基因組。我們用custom R和Python scripts及其他現有的工具分析產生的峰列表。

　　Kun Huang(俄亥俄州立大學)：

　　我們發現，在進行轉錄因子的常規分析時，商業化的軟件(如Partek)非常有用。然而，我們一般使用兩種或三種其他的峰檢出軟件包(MACS、 HOMER、SISSR)，來檢查峰檢測的一致性。對于長的區域，我們使用內部開發的算法。我們應用多種方法來尋找motif，包括鑒定已知的 motif，并通過ChIP-Motif等工具進行de novo motif發現。Partek motif分析工具也十分有用。

　　Jason Lieb(北卡羅來納大學教堂山分校)：

　　對于ChIP-seq數據，我們一般使用ZINBA，對于ChIP-chip數據，我們用MA2C。

　　Xiaole Shirley Liu(Dana-Farber 癌癥研究所)：

　　我們最喜歡Cistrome和CisGenome。

　　Kevin White(芝加哥大學)：

　　這是個快速發展的領域。我們今天所用的可能并不是明天所用的，因為峰檢出的方法在不斷改進。然而，我們現在正與斯坦福的Mike Snyder研究小組合作，重新分析來自modENCODE計劃的人、果蠅、蠕蟲和小鼠的ChIP-seq數據，以便為利用BWA和SAM工具進行比對和質量控制、MACS2進行峰檢出和IDR進行重復性分析的研究人員提供標準化的數據集。