專家經驗談：活病毒成像指南

　　對于大多數生物學過程來說，所見即所得。由于病毒在感染性疾病中的作用，許多生物學家希望能夠實時觀察病毒的活動。要觀察病毒感染細胞和病毒裝配的過程，熒光成像是少數幾種非介入性的途徑之一。進行這樣的研究需要帶靈敏相機的高質量顯微鏡，能支持每秒多次成像。還需要確認熒光標簽和實驗設置不會干擾到我們想要研究的目標。

　　麻雀雖小五臟俱全，病毒雖然小但其結構和功能是很復雜的。熒光成像技術是直接觀察病毒的非介入性途徑，不過我們也需要注意到一些問題，Crucell公司的資深科學家B?rries Brandenburg介紹道，“你需要對自己的病毒足夠了解”。病毒雖小，但也是很有組織性的系統。病毒實驗需要精心設計，才能確保所觀察到的熒光與您想要研究的生物過程有關。

　　The Scientist雜志就此請教了多位專家，為您奉上在活細胞中觀察病毒行為的一份指南。

　　如何選擇標記

　　做標記是追蹤病毒的第一步，成功的標記需要兼顧病毒和所要觀察的目標。病毒一般從25nm(如小核糖核酸病毒picornaviruses)到一微米長(如副粘液病毒paramyxoviruses)。在病毒基因組中插入一個編碼熒光蛋白的基因，是讓病毒發光的久經考驗的方法。對于較大的病毒(如400 nm的牛痘病毒)，人們一般選擇插入綠色熒光蛋白GFP或紅色熒光蛋白RFP等傳統熒光標簽，這樣并不會擾亂病毒的結構和功能。而對于平均直徑只有 100nm的流感病毒就很難用傳統熒光蛋白進行標記，因為這些蛋白的大小足以影響病毒的正常功能。

　　對于這樣的小病毒，需要使用熒光小分子通過化學方式標記病毒中的脂質、蛋白或者糖類。這樣的標記與特定的功能性分子結合，由于這種結合是非特異性的，所以在使用的時候無法確切了解到我們標記的是什么分子。不過也有給目標分子特異性添加化學標簽的新方法可供選擇。Whitehead研究所的Hidde Ploegh及其同事就開發了一種位點特異性的標記方法，使用能夠識別特定氨基酸序列的細菌酶來標記蛋白，他們目前就在利用這種方法檢測流感病毒顆粒。在PLoS Pathogens上發表的這項研究中，Ploegh及其同事對一種細菌的酶進行了改造，使其能夠識別兩個流感衣殼蛋白。并且使用標準多肽合成儀器給短肽加上了熒光標簽。這種方法能夠特異性識別帶有識別序列的蛋白。他們這項研究所用的都是現成試劑、固相多肽合成系統以方便獲得的酶，這些工具對于大多數生化學家和細胞生物學家來說都不難獲取。

　　還有一個基本的問題，我們該用多少熒光標記呢?Brandenburg介紹道，總的來說在不影響病毒生物學過程的情況下當然是標簽用得越多越好。隨著時間推移曝光會漂白熒光染料，因此熒光標記用得越多，你就能趕在染料褪色前觀察得越久。不過這里也有許多需要考慮的因素，如果你選擇將目標蛋白與熒光標簽結合起來形成融合蛋白，那么就要確保標記蛋白夠小折疊夠快。

　　不同的標記技術有不同的優勢。如果用GFP標記病毒中的蛋白，它能在病毒裝配時表達，你就可以在實驗中利用它來追蹤特定目標分子。我們也可以使用化學標記在特定的時間點標記病毒，這對于構建脈沖示蹤實驗pulse-chase非常有用，可以標記特定時間點出現在病毒上的分子并進行實時跟蹤。這樣的研究可以使人們在病毒生命周期中監控這些分子的改變。

　　發光的就是病毒么?

　　在標記了目標病毒之后需要進行一系列預實驗，我們得確認標記是否成功，以及我們是否能夠分辨單個病毒。由于可見熒光點通常比實際病毒要大，所以我們無法立刻判斷自己觀察的是否就是單個的病毒顆粒。要了解我們所觀察的樣本，簡單的光漂白實驗就是第一步。進行光漂白，我們就可以觀察到樣本中各光點熒光褪色的速率。這樣的速率越平均就說明樣本越均一，在成功標記的樣本中“大多數顆粒應該行為相似，”Brandenburg說。

　　根據不同病毒的特性，我們也許需要改變鑒定程序。例如，紐約洛克菲勒大學的Sanford Simon及其同事在進行HIV和丙肝研究時，就采取了不同的標準來區分完整病毒和其他熒光體。一開始，他們就發現自己遇到了挑戰，“因為之前還沒人觀察過單個病毒的組裝，我們并不清楚應該在顯微鏡下找什么，”他說， “我們甚至不知道裝配要花幾秒鐘還是幾分鐘。”

　　他們用GFP標記了HIV的結構蛋白Gag，并建立了四個針對病毒裝配的標準，他們發表在Nature上的論文詳細描述了這些標準。首先，他們觀察了樣本中光漂白的分布。隨后他們分析了顆粒重獲熒光的情況，完整的病毒重新發熒光的過程較為緩慢。接著他們通過熒光共振能量轉移FRET檢測熒光顆粒中蛋白的組織形式，完整病毒中的蛋白應該很緊密。最后，他們調節了樣本的pH值并用對pH敏感的蛋白進行監控，來確定病毒顆粒是否已經完全脫離了宿主細胞。

　　除此以外，我們可能還需要考慮到自己病毒的一些特性，不過Simon強調說關鍵是要設定明確的標準，以便日后可以重復實驗。

　　除了病毒還能看到什么?

　　病毒成像實驗不僅能夠檢測病毒的結構和行為，也為人們提供了疾病研究的窗口。

　　我們能夠利用標記了的病毒來跟蹤感染過程中的基因活動。西奈山醫學院的Adolfo García-Sastre及其同事就通過熒光標記技術來研究小鼠感染流感的模式，這項研究發表在美國國家科學院院刊PNAS上。他們構建了編碼GFP的基因工程病毒，以便追蹤被感染的細胞。這可沒有聽起來那么簡單，因為病毒很小，這樣的標記很難不影響到病毒的行為。研究人員標記了一個影響病毒毒力的蛋白，并跟蹤了該蛋白在小鼠肺部的表達，由此他們分析了抗病毒藥物oseltamivir所引起的變化。

　　García-Sastre認為成像工具可以幫人們解決以下問題：什么類型的細胞受到了感染，什么類型的細胞獲取了抗原，這些抗原何時消失，感染是如何傳播的等等。

　　深入病毒表層

　　熒光成像并不是跟蹤觀察病毒活性的唯一途徑。如果您感興趣的是病毒的結構或者病毒中較慢的生物過程，那么原子力學顯微鏡AFM也是一個好幫手，不過這一技術還未得到生物學家的充分利用。AFM在掃描樣本時實時生成圖像，這種方法檢測的是病毒的表面，要深入病毒內部就需要用試劑一層層剝開病毒，由此獲得的一系列圖像來揭示病毒內部的精細結構。

　　AFM的分辨率約為10 ?，這使其觀察小病毒的能力受到限制。不過對于較大病毒的成像來說，AFM非常好用，因為這種方法不需要進行結晶、染色和固定。AFM可以捕捉到活病毒中較慢的結構改變，如果您需要追蹤快速發生的生物過程，仍需選用熒光顯微鏡。

　　一般來說AFM的價格在150,000至200,000美金之間，AFM的操作間需要保持安靜并且做好防震。總的來說這一技術很容易上手，不過要得到高質量的圖像還需要操作者投入大量時間累積經驗。