如上所述，MAPK通常形成多層通路，接收比實際MAP激酶高幾層的輸入。與MAPKs和MAP2Ks相對簡單、磷酸化依賴的激活機制相比，MAP3Ks具有驚人的復雜調控。許多了解得更多的MAP3K，如c-Raf、MEKK4或MLK3，需要多個步驟來激活它們。這些酶通常是受變構效應控制的酶，通過多種機制緊密地鎖定在非活性狀態。激活它們的第一步是通過較小的配體（如c-Raf的Ras、MEKKK4的GADD45或MLK3的Cdc42）來減輕它們的自抑制。這通常發生在細胞膜上（但不總是），它們的大多數激活劑是結合在細胞膜上的（注意，由于異戊烯化修飾，小G蛋白是一直聯系在細胞膜上的）。此步驟之后是“背靠背”的對它們可訪問的激酶結構域的同源和異源二聚化。最近確定的復合物結構顯示二聚體的形成方向使它們的兩個底物結合區都自由。重要的是，這種二聚化事件還迫使MAP3激酶結構域采用部分活性構象。只有當這些二聚體在它們的活化環上相互磷酸化時，才能達到完全活性。后一步驟也可以通過輔助蛋白激酶（MAP4激酶，Ste20家族的成員）實現或輔助。一旦MAP3激酶完全激活，它可以磷酸化其底物MAP2激酶，這反過來又讓MAP2激酶磷酸化它們的MAP激酶底物。