中和實驗是一種特異性和敏感性均很高的血清學實驗。在體外,病毒可以被相應的特異性抗體中和而失去其感染性,通過單層細胞培養檢驗病毒的感染性是否失去的方法稱為中和實驗。
中和實驗是以測定病毒的感染性為基礎,所以該實驗必須在動物,雞胚或組織培養細胞等活性體內進行,必須選用對病毒敏感的細胞,動物或雞胚為材料,根據實驗的不同目的設置嚴格的對照實驗。
中和實驗的主要應用是:
1 鑒定病毒:中和實驗具有很高的特異性,利用已知型別的免疫血清與未知病毒做中和實驗,如被中和,不但可以定量,而且可以定性。
2 可以用于分析病毒的抗原性。
3 測定免疫血清的效價和疫苗免疫后的抗體反應。
4 測定血清中的抗體滴度,用于診斷病毒性疾病。
[原理] 特異性的抗病毒免疫血清——中和抗體與病毒作用,能夠抑制病毒對敏感細胞的吸附、穿入和脫殼,從而抑制了病毒的增殖,使 病毒失去感染性,中和實驗常用有兩種方法:一種是用已知病毒檢測被測血清中的抗體效價,另一種是用已知免疫血清鑒定病毒型別。
一 )中和實驗方法一——用已知病毒檢測被檢血清中的抗體效價
1 材料
1 )病毒懸液:選用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰質炎病毒液各 1.5ml 。使用前用 Eagle 維持液稀釋至 100TCID50/0.1ml 含量( TCID50 即能使 50% 組織培養管發生細胞病變的病毒量)
2 )待檢血清;用前 56 ℃ 30 分鐘滅活,以除去非特異性抑制物
3 )敏感細胞:需長成單層,一般需 2-4 天,根據細胞種類和繁殖程度確定,本實驗選用 Hela 細胞培養管 40 只。
4 )滅菌 Eagle 維持液、滅菌小試管 15 只、滅菌 1ml 吸管, 37 ℃水浴箱, 37 ℃ 5%CO 2 培養箱和顯微鏡。
2 方法
a 實驗組實驗方法( 1-5 號管)
1) 稀釋血清:取 15 支滅菌試管,分成三排,每排 5 只分別編號。將待檢血清用 Eagle 維持液從 1 : 5 按四倍遞增稀釋到 1:1280, 稀釋后的血清每管 0.25Ml.
2) 在第一排各試管內,每管加入Ⅰ型病毒液 0.25ml ,第二排各試管內,每管加入Ⅱ型病毒液 0.25ml ,第三排各試管內,每管加入Ⅲ型病毒液 0.25ml ,加完后搖動試管架充分混勻,置 37 ℃水浴箱 1 小時取出。
3) 取 30 只 Hela 細胞培養管,棄去培養液,在每支培養管中加入上述病毒與血液混合液 .0.2ml ,每份混合液接種 2
支細胞培養管。接種后,培養管置于 37 ℃水浴 1 小時取出,于每支培養管內加入 0.8mlEagle 維持液,送 37 ℃ 5%CO 2
培養箱培養。
b 實驗對照組實驗方法
1 )病毒對照組(6號管)
取 6 只 Hela 細胞培養管,棄去培養液,每支試管中加病毒液 0.1ml ,每型病毒液各接種 2 只培養管。然后送 37 ℃水浴保溫 1 小時取出,于每支培養管中加入 0.9mlEagle 維持液,送 37 ℃ 5%CO 2 培養箱 培養。