中科院李勁松團隊等篩選小鼠骨發育中的關鍵基因

　　大規模隱性遺傳篩查是一種用于鑒定生物過程基因的有效方法。這種策略在低等生物中已經成功，如酵母（釀酒酵母）和線蟲（秀麗隱桿線蟲）。在哺乳動物生物中，由于它們的二倍體基因組，這種功能篩選具有挑戰性。RNA干擾（RNAi）目前用于通過靶向mRNA在哺乳動物細胞中進行基因組規模的功能喪失篩選；然而，這種方法通常不足以抑制基因表達，并對其他mRNA具有脫靶效應。CRISPR-Cas9系統已經應用于小鼠和人細胞中的有效功能喪失篩選。然而，迄今為止，CRISPR-Cas9介導的基因組規模篩選僅在細胞水平上使用，限制了其應用于基于細胞的表型。

　　從單性生殖或雄激素胚泡中產生哺乳動物單倍體胚胎干細胞（haESCs）為細胞水平的遺傳分析提供了理想的工具。雄激素haESCs（AG-haESCs），其基因組來自精子，支持胚胎注射到成熟卵母細胞，活體動物被稱為半克隆（SC）動物。此外，攜帶組成型表達的Cas9和單指導RNA（sgRNA）文庫的DKO-AG-haESCs允許一步產生突變小鼠，顯示在小鼠的生物體水平上進行功能性誘變篩選的可能性。

　　2019年7月2日，中科院分子細胞科學卓越創新中心（生物化學與細胞生物學研究所）李勁松聯合鄒衛國團隊等人在PLOS Biology上發表題為“Targeted genetic screening in mice throughhaploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development”的文章，建立了一種體內遺傳篩選策略，以基于ICAHCI技術和CRISPR-Cas9文庫的組合應用來鑒定參與骨發育的基因。

　　研究人員使用Cas9B-3-BD細胞進行ICAHCI實驗，產生突變小鼠。試圖通過骨骼分析來識別骨骼發育中涉及的關鍵基因，這些新生SC幼崽可能覆蓋69個候選基因。為了測試來自Cas9B-3-BD細胞的所得SC幼崽中的突變率，研究人員分析了3個ICAHCI實驗產生的總共39個SC幼崽。sgRNA插入分析表明38只幼崽攜帶1個sgRNA。

　　Sanger測序的常規基因分型分析顯示其中29個在sgRNA靶向位點攜帶突變，其中21個攜帶純合或雙等位基因突變，效率為55.3％，顯著高于先前報道的效率30.5％（83/272）。 TIDE或胸腺嘧啶和腺嘌呤（TA）克隆分析顯示，21個純合子或雙等位基因突變小鼠中有13個攜帶框內突變/野生型序列，總序列少于30％。同時，TIDE結果顯示12只SC幼崽攜帶超過2種類型的等位基因，與在Runx2被靶向時的早期觀察結果一致。總之，這些結果表明，使用具有靶向sgRNA文庫并組成型表達Cas9的Cas9B-3-BD細胞，可以通過ICAHCI有效地產生突變小鼠。

　　通過產生突變小鼠系驗證Rln1和Irx5

　　誘變篩選對于鑒定參與發育過程的關鍵基因是有效的。然而，這種篩選僅在低等生物中成功。該研究通過結合雄激素單倍體胚胎干細胞（AG-haESCs）和CRISPR-Cas9技術，在小鼠中開發靶向遺傳篩選方法。通過卵母細胞注射攜帶組成型表達的Cas9的AG-haESCs和指導72個預選基因的單指導RNA（sgRNA）文庫，通過骨骼篩選骨發育相關基因，制備突變半克隆（SC）小鼠庫。發現了4個基因：骨骼發育所需的Zic1和Clec11a，以及之前未考慮過的Rln1和Irx5。

　　盡管Rln1  -/  -小鼠僅在出生時表現出較小的骨骼，但骨量減少和骨髓脂肪生成增加，Irx5-/-小鼠在出生后和成人階段都顯示出骨骼異常。IRX5通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）活化來促進成骨細胞生成并抑制脂肪形成。因此，AG-haESC介導的功能性誘變篩選為小鼠發育過程的遺傳查詢開辟了新的途徑。