中等量細胞克隆的雜交法篩選實驗

重組質粒轉化的 E.coli

LB 或 SOB 瓊脂板硝酸纖維素膜注射器針頭防水黑色墨汁Whatman 3 MM 圓形濾紙

一、材料

1. 培養基

(1) 含有適當抗菌素的 LB 或 SOB 瓊脂板（90 mm)。

本方案中使用 2~3 天的舊板效果最好，因為舊板更容易吸收接種物中的水分。

(2) 含有氯霉素的 LB 或 SOB 瓊脂板。

氯霉素貯存液濃度應為 170~200 μg/ml。

2. 專用設備

(1) 硝酸纖維素膜（Millipore HATF，或相當產品）或尼龍膜，無菌無去污劑污染。

(2) 注射器（3 cc），針頭（23 號）和防水黑色墨汁（India 墨汁）。

以上材料用于標記濾膜在瓊脂板上的方向。

(3) Whatman 3 MM 圓形濾紙。

提前準備一疊 Whatman 3MM 濾紙（毎一硝酸纖維素或尼龍膜各準備一疊，還要加一些備用品），并裁減成比濾膜稍大一點。一些廠家已有預制好的圓形濾紙出售。

3. 載體和菌種

重組質粒轉化的 E.coli，用作培養物。

二、方法

1. 將轉化菌培養物鋪于 90 mm LB 或 SOB 瓊脂板，菌液濃度應調整為可長出 2500 個菌落。當菌落長至平均大小為 1.5 mm 后，將瓊脂板從培養箱移至冷室。

2. 用軟鉛鉛筆或圓珠筆在干濾膜上作好標記，用水浸濕后將濕濾膜夾在干的 3 MM 濾紙之間，用鋁箔松散地包好，液相循環高溫高壓消毒 [ 15 psi (1.05 kg/cm² ) 10 min ]。

準備足夠的濾膜用來從起始板制備 1 或 2 張備份。備份最好用消毒的無菌濾膜，但如果不再從主板制備備份，未消毒的濾膜也可以用。

3. 將干的無菌無去污劑污染的硝酸纖維素膜標記面向下鋪于 LB 或 SOB 瓊脂板表面，與菌落接觸（步驟 1 完成），直至濾膜完全浸濕。

小心防止濾膜和瓊脂間產生氣泡，氣泡會造成假像。最好是先使濾膜稍微卷曲，使濾膜的中部首先于瓊脂接觸。濾膜接觸瓊脂后，不要移動濾膜。

4. 濾膜一就位，立即用與注射器連接蘸有防水墨汁的 23 號針頭在三個或更多不對稱的位置上作好標記。

23 號針頭或更小一些墨水蘸點最好（毎板蘸一次，每板三個孔 )。

實踐中，用空的 18 號針頭在濾膜和下層球脂間穿孔而避免使用墨水（墨水會弄得很臟），是可能的。雜交后，通過來自光盒的背光可以對濾膜上的孔與瓊脂上的痕跡進行校對。

很多研究者更喜歡用剪刀在濾膜四周不同位置上剪出缺口的方法來確定方向。將剪出缺口并作好標記的濾膜置于瓊脂表面，而后在培養板背面標記出濾膜鋸齒狀邊緣的位置。這樣通過鋸齒的形狀和位置就可確定在培養板上的方向。

5. 用平口鑷子夾住緊濾膜邊緣，以平穩的一次性動作將濾膜從瓊脂板表面揭下。

通常克隆是整體地從瓊脂轉向濾膜，但會在培養基表面遺留下凹痕，當主板在 37℃ 溫育，長出的細菌可添滿凹痕，但不會再擴大了。

6. 視情況而定，進行以下程序之一：

(1) 裂解濾膜上的菌落，并將釋放的 DNA 固定于硝酸纖維膜或尼龍膜。進行雜交。

(2) 裂解菌落，替代固定 DNA。

(3) 將濾膜的菌落面向上，置于一塊新的含有適當抗菌素的 LB ( 或 SOB ) 瓊脂板表面，培養若干小時，待菌落長至 2~3 mm 后，揭下濾膜進行裂解和雜交。

只有在克隆向濾膜轉移時板上克隆數很少或參差不齊時，進行以上操作。但這種情況并不多見。

(4) 將濾膜置于含有氯霉素（170~200 μg/ml）的瓊脂板上，于 37℃ 培養進一步 12 h 擴增，而后進行溶解和雜交。

這個擴增的過程只有在重組質粒的拷貝數預計很低的情況下（如插入的是較大的外源 DNA 片段)，或當簡并度較高的寡核苷酸用作探針時，是必要的。克隆的 DNA 片段通常很容易通過雜交被檢出，不需要預先進行重組質粒的擴增。擴增只對那些以松散方式復制的質粒是有效的。

(5) 用濾膜制備二次備份：

① 將濾膜的菌落面向上，置于一塊新的含有適當抗菌素的 LB 或 SOB 瓊脂板表面。

② 小心地將一張干的硝酸纖維膜置于第一張膜的上面，按上述步驟 4 方法進行標記。

③ 將“濾膜三明治”于 37℃ 培養數小時。

如有需要，在含有氯霉素的瓊脂板上進一步培養，擴增質粒。

④ 進行溶解和雜交，在溶解和中和步驟中保持濾膜三明治，而在最后洗脫時將其揭開（Ish-Horowicz and Burke. 1981)。

7. 主板于 37℃ 培養 5~7 h 直至菌落再次長出，用 Parafilm 膜封好，倒置后于 4℃ 保存。