(七)污染
在實際工作中，常見有以下幾種污染類型：擴增片段的污染(產物污染)；天然基因組DNA的污染、試劑污染(貯存液或工作液)以及標本間交叉污染(如氣溶膠從一個陽性標本擴散到原本陰性的標本)。臨床基因擴增檢驗實驗室中污染的最主要來源是擴增產物的污染。
由于一旦發生污染后，再圍繞實驗室來尋找污染源不僅耗時而且還很繁瑣，所以防止污染重在預防。但如果發生了污染，實驗就必須停止，直到發現了污染源為止，并且實驗結果必須作廢。
1、測定分析前的污染源
測定分析前實驗材料的污染主要來自非病人標本來源的核酸。
2、測定分析階段的污染源
通常，測定分析階段的每一步都可能發生對樣本的污染。反應混合液的任何成分及核酸的制備和反應建立階段所涉及到的實驗設備的任何部位都是可能的污染源。如受污染的試劑(例如牛血清白蛋白，明膠或礦物油)、商品酶制劑、消耗品(如反應管，吸頭)和實驗設備(如加樣器、離心機)等。
在前面三個工作區中，不當的實驗操作會引起所使用的試劑、消耗品或實驗設備的污染。而在產物分析區，當吸取擴增產物用于檢測時，非常容易引起污染，因此必須制定標準操作程序(SOP)，并嚴格執行。
3、污染的避免
要避免污染，首先應是預防而不是排除污染，前面所述對工作區的嚴格劃分的目的即是為了預防污染。
為避免以前測定中所產生的擴增產物的污染，可設法將其破壞掉。如在擴增反應中用dUTP取代部分dTTP，使得產生的特異擴增片段含有尿嘧啶，這樣擴增前在反應混合液中加入尿嘧啶糖苷酶(UNG)，可破壞來自以前測定的擴增產物，從而避免其對以后要進行的擴增測定的污染。另外一種方法是持續的長波紫外燈照射，通過異補骨脂素光化學產生DNA加合物，由于DNA加合物對擴增沒有反應但又不妨礙PCR后雜交過程，所以這種方法也能防止污染。
上述防污染方法只在一定程度上有效，所以不能用其來替代嚴格的實驗室設置和管理，尤其是這些方法不能防止外來非擴增的天然DNA的污染。
4、去除污染的措施
工作完后必須定期對實驗室采取有效的去污染措施，結合各種不同的方法可達到最佳效果。去污染措施包括但不僅限下面幾種：(1)用10%(v/v)次氯酸鈉清潔表面；(2)試驗后長時間的紫外照射實驗操作臺面和其他表面；(3)實驗設備如加樣器的高壓消毒。
(八)擴增產物的分析
擴增產物的測定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點印跡、探針雜交、測序、分光光度法定量等，但臨床PCR檢驗項目基本上都使用探針雜交方法。
雜交結果不充分的原因可能是基因探針不合適、標記方法不對、對探針的標記不夠、雜交或洗滌方法不合適等。
最常使用的基因探針有：DNA片段、合成的寡核苷酸和體外轉錄的反義RNA探針。探針的標記物常用的有生物素、地高辛、熒光素和同位素等。
在擴增后的雜交檢測中,
應該嚴格遵守商品試劑盒確定的雜交程序和雜交條件。溫度太低或離子強度太高都會降低雜交的嚴格性，還會給檢測信號的特異性帶來負面影響。相反，提高溫度和/或降低離子強度會增加雜交的嚴格性。因此，嚴密控制溫度和試劑的離子強度是避免假陽性和假陰性結果的先決條件。要注意的是，溫度和離子強度不能同時改變。
(九)質量控制
質量控制包括兩個方面，即室內質量控制(以下簡稱質控)和室間質量評價。
1、室內質量控制
必須對DNA和RNA分析的各步進行質量控制，以避免假陽性和假陰性，保證測定結果的準確性和重復性。由于核酸擴增測定的高敏感性，所以標本制備、逆轉錄、擴增本身和產物分析中的每一步都要求有質控措施。
(1)標本制備：
常用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA提取效果，以判斷所提取的DNA是否發生降解。用常規的手工提取方法制備的DNA的平均長度一般為~100kb，用適合PCR的DNA提取試劑盒制備的DNA的長度平均范圍為30-40kb。明顯出現降解的DNA(在1和10kb的低分子量范圍內)在經瓊脂糖凝膠電泳分離和用溴化乙錠染色后也可見強的熒光信號。用對甲基化不敏感的限制性內切酶(如EcoRI)消化DNA，然后電泳分離，能夠對酶活性的抑制劑進行質控(在抑制劑存在的情況下，高分子量的片段不被酶切)。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測定來估計，質量好的DNA提取物，A260/A280比值應該在1.75~2.0之間;否則,殘留的蛋白或酚可能會很高。僅用光度計比色方法不能對DNA的完整性下結論。
最快的對總RNA提取質量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電泳,這一點跟DNA分離相同。但如果對結果有疑問,就應該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA的完整性。在理想情況下,三種主要的核糖體RNA(28S、18S和5S)在凝膠上出現的帶相對較窄。如發生RNA的降解，則出現大量低分子量帶或出現帶的消失。測定核糖體RNA帶的密度指數可作為對RNA制備的質量評價的實驗室內的標準；對向低分子量拖尾的、不對稱性的峰的評估也是RNA完整性的合適的指標。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。由于這些原因，單獨的光度計比色方法也不能對RNA的完整性下結論。
對于血清（漿）中病毒的測定，則要評價標本出現溶血、脂血和黃膽情況下標本處理方法對擴增檢測的影響，避免由于標本處理方法的不當而出現假陰性結果。此外，還可采用已知濃度標本評價核酸提取方法的效果。
(2)逆轉錄和擴增：本部份包括陽性質控和陰性質控。
對逆轉錄和核酸擴增的質控既可使用內標質控方法也可采用外標質控方法。逆轉錄-擴增檢測的內標通常為在整個細胞周期中均勻表達的mRNA，如HLA、β肌動蛋白和組蛋白H3.3的mRNA或14S
rRNA等。此外，也可在標本制備時將外來內標加入到樣本中共同提取、逆轉錄及擴增。當標本中存在逆轉錄抑制物，或核酸提取中發生RNA降解，或逆轉錄酶失活，內標即會表現為陰性結果。
對于DNA測定內標可使用對有機體存活所必須的靶基因，如維生素D血漿結合蛋白的基因。對于病原體的基因檢測，內標多采用人工制備的競爭性內標。內標可以監控每一擴增孔中假陰性的產生情況。
目前的商品試劑盒大部分沒采用內標方法質控。因此在測定血清/血漿病原體核酸如HBV DNA、HCV RNA等時，應使用已知的弱陽性血清/血漿作為質控樣本，與待測臨床標本等同處理提取核酸及擴增，以判斷逆轉錄及擴增檢測的效果。
使用這些外加弱陽性質控不但可檢測擴增反應液的質量，還可獲得有關PCR試劑的檢測下限和特異性的信息。這些質控樣本在擴增檢測時必須使用與患者的標本相同的主反應混合液。
每一個PCR實驗中都必須設有外加陰性質控(污染監測質控)，為判斷擴增過程中污染出現的階段，陰性質控可包括如下幾種，即在樣品制備的整個過程中所帶的空白管、僅有擴增反應液但不含擴增模板的反應管、陰性標本等。陰性標本可以評估PCR實驗的綜合質量。
在擴增靶RNA的RT-PCR實驗中，可做省略逆轉錄的污染質控，通過這種方法，可發現以前擴增的DNA片段所引起的污染。
(3)板上雜交和膜上斑點印跡雜交的質控：在板上雜交和斑點雜交時，陽性和陰性質控應該在同一板或膜上與病人標本平行進行分析，這可排除不同反應中因使用不同雜交條件所致的對結果的錯誤解釋。
(4)測定結果的評價與報告：采用實時熒光定量PCR檢測方法，在判斷結果時，應先對擴增的熒光信號作出定性判斷，然后再進行定量分析，避免一些非特異熒光信號對結果分析的干擾。
結果的報告必須簡單清楚。定性測定報告“陽性”或“陰性”即可。定量測定則必須報告量的多少，如結果高于測定方法線性范圍上限，則對樣本稀釋后再測，結果乘上稀釋倍數；如結果低于方法的測定范圍下限，則報告<多少即可，不能報告為“0”或“陰性”。
2、室間質量評價
所有開展臨床基因擴增檢驗的實驗室都必須參加由衛生部臨床檢驗中心組織的全國臨床基因擴增檢驗項目的室間質量評價，評價結果將作為其開展臨床基因擴增檢驗的依據之一。
本工作規范自公布之日起實施。