乙肝表面抗原（HBsAg）是臨床上應用最多的HBV感染血清標志物，它是WHO公認的判斷HBV感染的關鍵指標【1】。HBV復制周期快且聚合酶易錯配，導致HBV復制過程中突變率非常高。在內源性（宿主免疫清除）和外源性（疫苗、HBIG和抗病毒治療）選擇壓力下非常容易選擇出新的逃逸突變株。HBsAg突變會造成檢測試劑的漏檢，這對于輸血和手術安全構成重大隱患，也會對疾病進展和療效判斷造成重要影響。因此，研究如何提高對HBsAg突變體的檢出能力，具有重要意義。
HBsAg的突變及其后果
HBV的基因組包含4個開放讀碼框（ORF），分別為S、C、P和X。這4個讀碼框分別編碼病毒的包膜S蛋白(HBsAg)、核心C蛋白(HBcAg)和HBeAg、聚合酶及X蛋白。S-ORF全長1167nt，由Pre-S1、Pre-S2和S基因組成，分別編碼前S1蛋白、前S2蛋白和HBsAg，前兩者與HBV感染肝細胞有關，HBsAg是引起機體產生保護性免疫的主要成分。HBsAg由5個跨膜區及3個膜外區構成，HBsAg暴露在表面由99-169位氨基酸（aa）組成的區域，稱為主要親水區（MHR），具有免疫原性。HBsAg的免疫優勢區域“a”決定簇就位于MHR中，在所有基因型中均存在。針對“a”決定簇的抗體可對HBV所有基因亞型提供保護性免疫，“a”決定簇也是檢測HBsAg 的主要靶點【2】。
HBsAg的突變，主要四種類型：
（1）自發性突變：HBV的生活周期存在逆轉錄過程，而且DNA多聚酶不具備自我糾錯（self-proof）功能，因此存在較高的自發性突變率【3】，HBV的突變率是一般DNA病毒的10倍。慢性乙型肝炎患者體內HBV自然變異率約為1.4-3.2*10^5/位點/年【4】。此外，突變有一定的傾向性，主要發生在BCP區，前C區、P區和S區的“a”決定簇【5】。
（2）人群選擇：根據HBV基因組序列差異性≥8%，可以將HBV劃分為9個基因型，分別命名為A-I。依據S基因序列差異性≥4%，又可將HBV基因型劃分為20個亞型：A1-A3，B1-B4，C1-C4，D1-D4，E，F1，F2，G，H和I【6】。根據HBsAg第122位和160位氨基酸的差異可以將HBsAg分為adr，adw，ayr，ayw共4個血清型。不同的HBV基因型是病毒變異后的穩定形式，是多年人群選擇壓力的結果。
（3）免疫逃逸：疫苗和免疫球蛋白治療導致的逃逸突變主要源自于免疫壓力。免疫逃逸的結果導致出現了疫苗逃逸突變株、診斷逃逸突變株。中國實行普遍的乙肝疫苗接種計劃，更使得乙肝疫苗逃逸突變大大增多。大型乙肝疫苗接種程序數據顯示，HBsAg突變導致了2%-3%的疫苗逃逸突變，特別是145位點甘氨酸置換為精氨酸（G145R），此位點突變使抗原不能結合到野生型抗-HBs【7】。
（4）耐藥突變：核苷類似物用于治療慢性乙型肝炎患者導致聚合酶突變，由于S基因和P基因的RT區具有部分重疊，RT區的基因變異也可以導致HBsAg出現氨基酸的改變。隨著核苷類似物在臨床上的廣泛使用，這種可能性日益增加【8】。
HBsAg的突變會引發以下臨床事件：（1）疫苗保護失敗，HBsAg主要抗原決定簇重要氨基酸的改變會導致預防接種失敗。（2）診斷試劑漏檢，由于氨基酸的改變影響了抗原抗體的結合能力而造成實驗室診斷的假陰性結果。（3）抗病毒治療失敗，由于HBsAg與聚合酶重疊，HBsAg突變可能會改變聚合酶，從而導致核苷類似物治療的失敗。（4）HBsAg陰性的隱匿性乙型肝炎，這些感染者如果作為獻血員和肝移植供體將會通過輸血和肝移植傳播HBV。（5）加速HBsAg陰性乙型肝炎患者向肝硬化進展，同時容易引發免疫抑制后HBV再活動甚至是暴發性肝衰竭。（6）抗病毒治療期間假HBsAg血清學轉換或血清學清除，即由于S基因突變，而表現為HBsAg血清學轉陰【8】。
HBsAg突變體檢測是乙肝篩查的重點
HBsAg突變所造成的漏檢，對于獻血安全、疾病進展和療效判斷都有很大影響，因此提高HBsAg突變檢出率十分必要。Huang等報道【9】，在中國人群中HBsAg主要親水區（MHR）發生突變的概率很高，在隱匿性乙肝感染者中達到55.7%，在HBsAg攜帶者（血清HBsAg ≤100IU/ml）中達到34.0%，在HBsAg攜帶者（血清HBsAg＞100IU/ml）中達到17.1%。如此高的HBsAg突變率，使得當前的HBsAg試劑檢測能力下降，這對檢測試劑對于HBsAg突變體的靈敏度提出了更高要求。
目前用于HBsAg篩查的免疫學方法主要有金標法、酶免法（ELISA）、化學發光法（CLIA）等，其中化學發光法具有很高的靈敏度和特異性，逐漸替代金標和酶免法，成為主流。但是市場上的發光試劑品牌種類繁多，對HBsAg突變體的檢測能力差距很大，如何選擇理想的試劑，避免漏檢，成為檢驗科面臨的重要課題。
Natale等報道【10】，使用意大利索靈LIAISON XL系統與廠家A系統，對包含10種HBsAg常見突變體的血清盤進行了評價，結果表明，索靈試劑能將這10種突變體全部檢出，而廠家A試劑有兩種漏檢（表1）:
表1：HBsAg常見突變體血清盤的評價
Dorizzi等報道【11】，用同樣的這個包含10種HBsAg常見突變體的血清盤，評估索靈和其他幾個進口廠家的HBsAg試劑的突變體檢測能力，發現與以上報道類似的結果，索靈可以全部檢出這10種突變體，優于其他廠家。
Ly等報道【12】，使用包含54種重組HBsAg突變株和71種天然HBsAg突變株的血清盤對幾種主流進口化學發光法HBsAg商業檢測試劑進行評估，發現索靈在總計125種HBsAg突變體中檢測出111種，表現出最優的突變體檢測能力（表2）：
表2：HBsAg突變體檢測評估比對
總之，目前HBsAg突變在中國人群中十分普遍，如果篩查和診斷試劑對突變體的靈敏度不夠，會造成漏檢的嚴重后果，威脅輸血、手術和其它醫療操作的安全，也會給醫患關系帶來麻煩。因此，使用性能優秀的試劑，提高檢驗科對HBsAg突變的的檢出能力，具有重要意義。
參考文獻
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