注意事項
1、免疫透射比濁法:
(1)關于抗血清:比濁測定與其他方法相比對抗血清的要求更高。比濁法以用多克隆抗體為宜。抗血清中必須不含雜抗體。必須十分重視從人血清中提取的apoA-Ⅰ達到免疫純、色譜純與電泳純,這不是一般實驗室都能做到的。抗血清效價(滴度)不可低于16。目前國內某些商品試劑中,apoA-Ⅰ抗血清效價極低,選購試劑盒時必須注意。如果沒有在選購前鑒定抗血清質量的經驗,應請有條件的單位鑒定之。
(2)上法中標本(血清)稀釋200倍是為了便于手工操作(加樣100μl),如有精密加樣器,可作20倍稀釋(用10μl)。為了適合不同實驗室的條件(如不同類型的自動化儀器),作適當修改時應注意抗原抗體的比例,必須十分注意反應體系中不可有抗原過量,線性上限不可低于2.5g/L。換言之,抗血清用量必須充裕,否則標本中apoA-Ⅰ高水平時測出結果偏低。目前國內某些商品試劑盒不但抗血清效價過低,操作中所定標本用量又過大(如3~5μl),抗體明顯不足,測出結果必然不準確。
(3)為了達到準確測定的目的,apoA-Ⅰ與B比濁測定(終點法)中必須作校準曲線計算結果。一定范圍(低標本用量)濃度(X)與濁度(Y)基本上成直線關系,直線回歸計算出在Y軸上有一定截距(A值<0.1),所以用單點校準計算結果偏差較大,使測出結果不能準確反映濃度的高低(高的偏低,低的偏高)。千萬不要因為單點法簡便而忽略了測定的準確性。無論用何種自動化儀器,必須先試作校準曲線。如果在所用儀器及特定條件下反復測試,回歸線的截距不明顯時,才能采用單點校準法。標本用量在3~5μl時,即使加大抗血清用量,濃度與濁度也不成直線關系,只能用曲線直線化轉換后計算。
(4)主要干擾因素是血清本身的混濁(如高脂血清),用超離心或脂肪酶水解等標本預處理方法都不實用。用表面活性劑消濁的作用也有限,所以在測定中必須作標本空白管。除了自動分析中可采用兩點法外,手工法用單一試劑而不扣除標本空白的做法是錯誤的。為了減少基質效應對濁度反應的影響,必須用定值血清作校準物。此外,塵埃粒子、比濁皿劃痕等干擾也必須排除。
(5)有的商品試劑盒(包括某些進口產品)所附校準血清定值不準確,是誤差的重要來源。
2、火箭電泳法:
(1)抗原稀釋倍數與抗血清用量的選擇,應以火箭峰清晰、校準曲線斜率適中并成直線為宜。本法同時測定apoA-Ⅰ與apoB,應調整兩種抗血清用量,使二者峰高有區別,apoB峰高不小于1cm。
(2)不同種類來源的抗血清(如兔與羊),在等效價的情況下進行試驗,結果會有差異。apoA-Ⅰ測定以兔抗血清為好。用兔血清時峰形尖細,而羊血清所產生的峰粗,峰尖圓鈍,有時在峰頂前出現虛影。校準血清所作校準曲線斜率也不同。但不論用何種抗血清,定量結果差別不大。
(3)在一定條件下電泳,不同稀釋度校準血清的峰高不會有明顯變動,校準曲線斜率基本一致。如標本峰高超出校準曲線范圍時,應調整標本稀釋倍數后重測。板間CV通常小于5%。
(4)火箭電泳結果可以用染色法或直接肉眼觀察可見的火箭峰。前者用標本少,節省抗血清,但如適當增加標本及抗血清用量,不染色更為方便。所用瓊脂糖應為標準電滲或低電滲的,凝膠中加入適量葡聚糖或聚乙二醇可使火箭峰更清晰。
(5)火箭峰的測量可以計算面積或峰高,面積是峰高乘以峰寬(峰半高處的寬度)。測量精度最好能達0.1mm。須用機械或電子放大設備。標準曲線范圍內峰高以1~4cm為宜。
(6)本法適用于少量標本分析。也適用于apoAⅡ、CⅠ、CⅡ、CⅢ、D、E及Lp(a)測定。
檢查過程
1、免疫透射比濁法:
(1)標本應是及時分離的空腹血清,可密封存放在2~6℃冰箱中,1周內測定,-20℃可存放半年。
(2)用全自動分析儀時,應根據不同儀器設計參數,合理選擇抗原抗體比例及反應時間。也可作速率法散射比濁測定CM如用Beckman比濁儀ICS或protein array system)。
(3)手工法所用儀器:精密光度計,具有340nm濾光片(或分光器),樣品池體積以0.5ml為宜(為節省抗血清),最好用流動杯,樣品稀釋最好用稀釋器、經校正的加樣器。
(4)標本處理:將血清標本及質控血清各用樣品稀釋劑作1:200稀釋,即先作1:20稀釋(5.Oμl血清+95μl稀釋劑)后,再作1:10稀釋(多余的1:20血清作測定apoB用)。
混勻后,25~37℃放置30min,在波長340nm比濁,根據U-UB的A值,在標準曲線上讀出結果。
本法批間CV<5%。
(5)校準曲線:在手工與半自動操作中每批測定均需作校準曲線,可將校準血清稀釋成1:100、1:200、1:300和1:400等4種濃度,與標本同樣操作,根據定值計算出每個標準管CM濃度,以濃度(X)與其相應的A值(Y)作圖(用直線回歸計算),基本上成直線,但在Y軸上有一定截距,所以不能用單點標準。操作準確時濃度與A值的相關系數應在0.985以上。
如有高、中、低濃度的三份校準血清時,可與標本同樣操作,做三點定標,也可作五點定標(即高、中濃度的血清等量混合,及中、低濃度的血清等量混合,成為另兩份校準血清)。
本法線性范圍:0.4~2.5g/L。
2、火箭電泳法:
(1)澆板:每板用10g/L瓊脂糖10ml,沸水浴中融化,混勻,冷至50~55℃時加入CM抗血清50μl,apoB抗血清8μl(用量視抗血清效價而定),迅速混勻后倒在預置在水平臺上的玻璃板上,冷后放在4℃,20min后打孔,孔在板的陰極端,孔徑3mm,孔間距至少5mm,孔容量5μl。把板放入電泳槽,用濾紙搭橋。
(2)稀釋抗原:用0.15mol/L NaCl液將校準血清稀釋成1:100,1:150,1:200,1:300,及1:400(作校準曲線之用),血清標本按1:200稀釋,放4℃冰箱不得超過3天。
(3)加樣:在低電流狀態(10mA/板)將稀釋好的定值血清及標本分別吸取5μl(準確),加入瓊脂糖凝膠加樣孔內。每板都要做一系列標準。
(4)通電:穩流24mA/板,端電壓6~8V/cm,以流水冷卻使瓊脂糖保持15℃,電泳3~4h。
(5)脫雜蛋白及制干膠膜:電泳后的瓊脂糖板浸泡在0.15mol/L NaCl中30min,將膠膜托置于聚酯薄膜上,用多層濾紙在輕輕加壓下吸干膠內水分,然后將濾紙、膠膜與聚酯膜三者一起自然干燥,或用熱吹風器吹干,干后膠膜會自然與濾紙及聚酯膜分開。
(6)染色:將瓊脂糖膠膜平鋪浸泡于染色液內20~30min。
(7)脫色:用脫色液浸泡已染色的膠膜至火箭峰清晰,背景基本無色。可在水中用兩片玻璃紙將膠膜夾住,晾干后可長期保存。也可以用流水浸泡脫色至背景干凈。
附注:
①抗原稀釋倍數與抗血清用量的選擇,應以火箭峰清晰、校準曲線斜率適中并成直線為宜。本法同時測定apoA-Ⅰ與apoB,應調整兩種抗血清用量,使二者峰高有區別,apoB峰高不小于1cm。
②不同種類來源的抗血清(如兔與羊),在等效價的情況下進行試驗,結果會有差異。apoA-Ⅰ測定以兔抗血清為好。用兔血清時峰形尖細,而羊血清所產生的峰粗,峰尖圓鈍,有時在峰頂前出現虛影。校準血清所作校準曲線斜率也不同。但不論用何種抗血清,定量結果差別不大。
③在一定條件下電泳,不同稀釋度校準血清的峰高不會有明顯變動,校準曲線斜率基本一致。如標本峰高超出校準曲線范圍時,應調整標本稀釋倍數后重測。板間CV通常小于5%。
④火箭電泳結果可以用染色法或直接肉眼觀察可見的火箭峰。前者用標本少,節省抗血清,但如適當增加標本及抗血清用量,不染色更為方便。所用瓊脂糖應為標準電滲或低電滲的,凝膠中加入適量葡聚糖或聚乙二醇可使火箭峰更清晰。
⑤火箭峰的測量可以計算面積或峰高,面積是峰高乘以峰寬(峰半高處的寬度)。測量精度最好能達0.1mm。須用機械或電子放大設備。標準曲線范圍內峰高以1~4cm為宜。
⑥本法適用于少量標本分析。也適用于apoAⅡ、CⅠ、CⅡ、CⅢ、D、E及Lp(a)測定。