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  • 發布時間:2019-03-30 22:34 原文鏈接: 二氫硫辛酰胺脫氫酶的測定實驗_氧化反應

    NADH:硫辛酰胺氧化還原酶,硫辛酰胺脫氫酶。


    此酶發現于細胞中,游離形式(二聚體)存在,與多酶復合體結合,與丙酮酸脫氫酶復合體、酮戊二酸脫氫酶復合體以及分支的含氧酸脫氫酶復合體相似。


    此酶首先被 Straub(1939)發現,由于其在加入人為的電子受體如氰化鐵、二氯酚吲哚酚和醌后,可以催化 NAD(P)H 的氧化,由此得名。

    實驗方法原理

    此可逆反應可以從任一方向檢測。氧化型硫辛酸和其氨基化合物是可以購買到的,但是利用簡單的步驟就可使其還原。硫辛酸和其氨基化合物都可作為底物,有氨基存在,此酶的活性要強 5 倍。

    實驗材料

    酶樣品

    試劑、試劑盒

    磷酸鉀NADDTEDL-二氫硫辛酰胺

    儀器、耗材

    分光光度計

    實驗步驟

    實驗所需「試劑」具體見「其他」


    0.96 ml 實驗混合物


    0.02 ml 0.2 mol/L DL-二氫硫辛酰胺 4.0 mol/L


    0.02 ml 酶樣品


    開始加入 0.01 ml 0.1 mmol/L H2O2 溶液


    30℃ 時,于 340 nm 處吸收值發生變化,ε340=6.3×103 l/(mol·cm)。

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    注意事項
    其他

    試劑:


    0.1 mol/L 磷酸鉀,pH7.5


    0.1 mol/L NAD(游離酸,Mr=663.4;663 mg 溶于 10 ml 水中)


    0.1 mol/L DTE(二硫赤蘚糖醇,Mr=154.2;或二硫蘇糖醇,DTT,Mr=154.2;154 mg 溶于 10 ml 水中)


    0.2 mol/L DL-二氫硫辛酰胺(Mr=207.3;52 mg 溶于 1.25 ml 乙醇或者丙酮。原料溶液濃度的二氫硫辛酰胺不可溶于水中,而且不可溶于酒精。存在醇脫氫酶時,例如天然的乙醇可以與 NAD 反應形成乙醛和 NADH,因此必須排除這個酶的活性,若兩者選一,底物必須溶解于丙酮溶液中)。

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