五花八門的DNA甲基化檢測（上）

　　近年來涌現出不少DNA甲基化的檢測技術，少說也有十幾種。大致可以分為兩類：特異位點的甲基化檢測和全基因組的甲基化分析，后者也稱為甲基化圖譜分析(methylation profiling)。下面生物通給大家介紹一些常用的方法。

　　特異位點的甲基化檢測

　　甲基化特異性PCR(MS-PCR)

　　這種方法經濟實用，無需特殊儀器，因此是目前應用最為廣泛的方法。在亞硫酸氫鹽處理后，即可開展MS-PCR。在傳統的MSP方法中，通常設計兩對引物，一對MSP引物擴增經亞硫酸氫鹽處理后的DNA模板，而另一對擴增未甲基化片段。若第一對引物能擴增出片段，則說明該檢測位點存在甲基化，若第二對引物能擴增出片段，則說明該檢測位點不存在甲基化。

　　這種方法靈敏度高，可用于石蠟包埋樣本，且不受內切酶的限制。不過也存在一定的缺陷，你要預先知道待測片段的DNA序列，并設計出好的引物，這至關重要。另外，若存在亞硫酸氫鹽處理不完全的情況，那可能導致假陽性。

　　亞硫酸氫鹽處理+測序

　　這種方法一度被認為是DNA甲基化分析的金標準。它的過程如下：經過亞硫酸氫鹽處理后，用PCR擴增目的片段，并對PCR產物進行測序，將序列與未經處理的序列進行比較，判斷CpG位點是否發生甲基化。這種方法可靠，且精確度高，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態，但需要大量的克隆測序，過程較為繁瑣、昂貴。

　　聯合亞硫酸氫鈉的限制性內切酶分析法(COBRA)

　　DNA樣本經亞硫酸氫鹽處理后，利用PCR擴增。擴增產物純化后用限制性內切酶(BstUI)消化。若其識別序列中的C發生完全甲基化(5mCG5mCG)，則 PCR擴增后保留為CGCG，BstU I能夠識別并進行切割;若待測序列中，C未發生甲基化，則PCR后轉變為TGTG，BstUI識別位點丟失，不能進行切割。這樣酶切產物再經電泳分離、探針雜交、掃描定量后即可得出原樣本中甲基化的比例。

　　這種方法相對簡單，可快速定量幾個已知CpG位點的甲基化，且需要的樣本量少。然而，它只能獲得特殊酶切位點的甲基化情況，因此檢測陰性不能排除樣品DNA中存在甲基化的可能。

　　熒光定量法(Methylight)

　　此種方法利用 TaqMan? 探針和PCR引物來區分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亞硫酸氫鹽處理DNA片段，并設計一個能與待測位點互補的探針，隨后開展實時定量PCR。這種方法最大的優勢在于其高通量和高敏感性，且無需在PCR后電泳、雜交等操作，減少了污染和操作誤差。

　　Qiagen就提供了多種預制的MethyLight分析。EpiTect MethyLight PCR Kit包括了兩條甲基化敏感的TaqMan探針和2條甲基化不敏感的PCR引物。隨著目標序列甲基化狀態的不同，只有FAM標記的亞硫酸氫鹽轉化的甲基化 DNA特異的TaqMan探針，或只有VIC標記的亞硫酸氫鹽轉化的未甲化的DNA特異的TaqMan探針能與目標序列雜交。如果探針與DNA雜交則釋放出熒光信號。信號強度與PCR產物的量成正比，據此可計算出樣品的甲基化程度。

　　甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析

　　亞硫酸氫鹽處理后，甲基化與未甲基化DNA會存在序列差異，這種差異可通過熔解曲線分析來發現，因為甲基化DNA含有更多的GC，相對更難熔解。根據熔解溫度及峰型的變化，可輕易區分完全甲基化、完全非甲基化或雜合甲基化。高分辨率熔解(HRM)技術可檢出極微小的差別。

　　使用這種方法進行甲基化分析僅需一對引物，相比以往的方法更加快捷、簡便和精確。不過對儀器的要求頗高，需要帶HRM模塊的熒光定量PCR儀。目前市場上有多款PCR儀可滿足要求，包括Illumina的Eco、QIAGEN的Rotor-Gene Q、羅氏 LightCycler 480等。

　　焦磷酸測序

　　焦磷酸測序技術(Pyrosequencing)作為一種新的序列分析技術，能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑。

　　通過準確定量單個連續的CpG 位點上的甲基化頻率，焦磷酸測序本身能檢測并定量甲基化水平上的細微改變。在序列延伸過程中，根據C和T的摻入量來定量確定單個位點的C-T 比例。因此，不同位點的甲基化變異就能被準確檢測。由于焦磷酸測序提供了真實的序列數據，甲基化狀態也就以序列形式呈現。

　　QIAGEN目前提供三種焦磷酸測序儀器，通量由低到高，適合不同的應用。PyroMark Q24 的強項在于可對多達24個樣品進行焦磷酸測序。需要大樣品量的應用更適合在PyroMark Q96 ID 上進行。在考慮到處理成百上千個樣品所需的大量試劑時，運行通量最大化可能會使實驗成本變得很高。而PyroMark Q96 MD 裝有一臺高度靈敏的光檢測攝像頭，可以在減少試劑量的情況下對少量的DNA模板進行準確測序。

　　為配合焦磷酸測序，QIAGEN還推出了PyroMark CpG Assays。這些預設計的甲基化分析使用特別定制的算法來設計出焦磷酸分析所用的PCR和測序引物，從而實現了基因組內特異靶點的甲基化分析。