1、抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。
2、一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。
3、內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；
4、非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；
5、 DAB孵育時間過長或濃度過高；
6、 PBS沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要；
7、標本染色過程中經常出現干片，這容易增強非特異性著色。