產1,3丙二醇新型基因工程菌的構建

摘 要 以甘油為底物轉化生產1,3-丙二醇的生物合成途徑中，往往由于還原力NADH的不足，限制了1,3-丙二醇的合成，引起中間代謝產物3-羥基丙醛累積，進而抑制甘油脫水酶的活性，阻礙菌體的生長，嚴重影響1,3-丙二醇的合成途徑. 為了解決合成途徑中還原力不足這一主要矛盾，本文以大腸桿菌和克雷伯氏菌染色體DNA為模板克隆得到yqhD和dhaB、dhaT基因，構建雙啟動子表達載體pEtac-dhaB-tac-yqhD及表達載體pUC-tac-dhaT，成功共轉入E. coli JM109，得到可利用兩種輔酶（NADH、NADPH）將甘油轉化為1,3-丙二醇且傳代穩定的重組大腸桿菌雙質粒系統，發酵結果表明，1,3-丙二醇產量提高了28.6%. 圖6 表1 參17

    1,3-丙二醇（1,3-PD）是目前國際上公認的六大石化新產品之一，其主要功能是作為合成聚酯、聚醚和聚亞氨酯的單體[1]. 1,3-PD的生產方法有化學合成法和微生物轉化法[2~5]. 微生物轉化法以其利用可再生資源、清潔生產、對環境友好、有利于可持續發展等優點逐漸成為國內外研究的熱點. 目前利用自然篩選的微生物直接進行1,3-PD的發酵法生產存在產物濃度低、副產物復雜和甘油轉化率低等問題. 因此，利用基因工程技術構建高產菌株備受國內外研究者的青睞.通常，甘油厭氧轉化為1,3-PD屬于還原途徑，其中輔酶NADH作為還原當量起著關鍵的作用，輔酶NADH供應量不僅直接影響到1,3-PD的產量，而且NADH不足會導致3-羥基丙醛累積，對細胞生長有毒害作用. 因此，適當提高胞內NADH供應量及NADH/NAD比例，有望提高1,3-PD合成濃度[6]. 輔酶NADH價格昂貴，在工業生產中不斷添加NADH顯然是不可行的[7]. 因此需要用新的思路和方法來解決這一矛盾.
    最近研究發現，來自大腸桿菌的非特異性氧化還原酶是1,3-丙二醇氧化還原酶的同工酶（編碼基因yqhD，以NADPH為輔酶），比1,3-丙二醇氧化還原酶催化底物3-羥基丙醛的效率明顯提高[8]. 本研究室已成功地克隆和表達1,3-丙二醇氧化還原酶同工酶yqhD基因[9]. 在此基礎上，本研究以大腸桿菌和克雷伯氏菌染色體DNA為模板克隆得到yqhD和dhaB、dhaT基因，利用基因工程手段分別構建重組載體pEtac-dhaB-tac- yqhD和pUC-tac-dhaT，并在大腸桿菌JM109中共表達，重組大腸桿菌1,3-PD產量提高了28.6%. 研究結果為提高1,3-丙二醇產量提供了一種新途徑.