親和層析實驗：常規方法

實驗步驟

一、親和介質的選擇

親和純化的成功取決于是否選擇了合適的固相載體和配基。理想的親和介質 (如吸附配基的固相載體)應該具備孔隙大、理化性質高度穩定的特征。親和介質可以選擇性的捕獲相應耙標，既保證較弱的非特異性吸附，又可以在整個過程中維持良好的流動特征。

優選介質應具備便宜、易獲取和使用簡便的特點。親和介質可以是商品化的, 或通過適當的化學作用將配基吸附在固相載體上(詳見本章第4節)。下文將詳細討論如何選擇合適的親和介質（GEHealthcare,2007;GustavssonandLarsson，2006;Zachariou，2007), 并對一些需要重點考慮的因素進行總結。

1.固相載體材料的基本特征

介質顆粒及孔隙應大小一致，且具有良好的流動性能。介質的表面積與孔隙呈負相關，這直接影響固定化配基數量，繼而影響載量。孔隙與排阻限制相關，即一定尺寸范圍或大小(分子質量)的蛋白質不能進入孔隙。大孔不受排阻限制作用的影響，允許大分子無阻礙地接近固定化配基，但會降低表面積和配基密度，進而降低純化效率。根據Ren-kin方程(Renkin,1954)，孔隙的大小應該至少達到一個生物分子平均大小的5倍以上，才能更容易接近固定化配基。假設蛋白質平均大小為60A, 孔隙的大小應至少為 300人或更高。大多數常用載體都會滿足這一要求(表 26.1)。交聯可以增加一些軟凝膠介質的機械穩定性，但會減少孔隙率(孔體積），進而降低連接配基數量和結合能力。在大多數情況下，應具體問題具體分析，綜合考慮孔隙和表面積，以達到最佳應用效果。

此外，粒子的直徑和粒度分布也是需要重點考慮的因素。理論上，較小顆粒更利于外部流動相和粒子內部間更快的物質轉移, 流速高且保持高效的親和捕獲。但是會導致更高的流動阻力，發生粒子崩裂的概率更高，如對顆粒和樣品中的變性蛋白質等污染物的敏感性增加導致高負壓。很大程度上粒度的選擇取決于分離目的和方法。10顆粒最適合用于 HPLC分離，400顆粒適合于制備樣品。為避免較小顆粒填充空隙體積并限制流速，粒度分布應盡可能均一。

2.選擇性

親和介質的一個主要特點是其選擇性。復雜樣品中蛋白質的選擇是特異性的，這是由偶聯在介質上的特異性配基決定的, 其他組分與配基的結合作用是惰性的。由于通常用于離子強度低的溶液，所以支持物應具有親水性并帶有一定電荷, 但這些電荷也會導致負面的相互作用，即離子相互作用。很多商品化固相載體都可滿足這些要求, 有的是其天然結構，有的表面包被合適的材料。常見載體(如球狀瓊脂糖和纖維素)都可以從供應商處購買，如GEHealthcare的瓊脂糖凝膠(S印harose)、Bio-Rad的Affigel(表 26.1)。非特異性選擇由固相載體自身特性決定，如聚苯乙烯珠的疏水性、二氧化硅表面的負電荷。

用于結合特殊配基時，應對介質進行修飾，此時也會導致非特異性吸附。針對這些情況，應根據靶標的特征精心設計、篩選并優化化學吸附作用、配基、配基和介質間隔物的選擇性和效能, 同時降低非特異性結合。

3.穩定性

使用過程中，親和介質的理化性質必須穩定，這樣載體材料本身以及吸附的配基才不會與所用溶劑發生反應，樣品中可能存在的酶和微生物也不會使其被降解或破壞。通常制造商會提供商品化親和介質的化學相容性，應將其作為成功制訂純化程序的指導原則。

交聯瓊脂糖通常可以承受寬pH范圍(如pH3~12)、大多數水溶劑 (包括變性劑）、有機溶劑、修飾劑和酶的作用。而如玻璃和二氧化硅等材料在堿性條件下會水解而不穩定，因此, 通常在吸附配基前需要在這些材料表面進行涂層。介質也應該能承受物理作用力 (如壓力, 尤其是裝柱時)并在純化過程中保持不變。高壓能夠壓縮介質, 使其崩裂。與較堅固的載體，如二氧化硅、聚苯乙烯和其他高度交聯材料相比，瓊脂糖珠及其他軟凝膠介質更容易受到壓力影響。

整體柱是孔隙大、非顆粒型的單一介質，可以用許多不同的材料制造，如瓊脂糖凝膠、二氧化硅、GMA/EDMA、晶膠(cryogel)(MallikandHage,2006;Plievaaetal.，2009)。

整體柱除具有親和載體很多必備的特性外，還有以下特點: 流穿孔隙大、沒有無效體積、形成對流而非擴散以及髙流速縮短運行時程，并因此得到廣泛應用。此外，在柱層析過程中，介質不會被壓縮，壓力塌陷較少，可承受較寬的 pH范圍和劇烈的化學作用。但與傳統介質相比，整體柱也具有局限性，如載量低，每種整體柱的親和載體均需要特殊的制備程序，而且目前可用的親和形式有限等(MallikandHage，2006)。

4.磁性親和珠

通過在每個步驟中親和珠的迅速再生(如結合、流穿、洗脫），磁性分離可顯著縮短純化過程，而且與傳統的柱洗脫相比可減少樣品的稀釋倍數。黏性材料會堵塞層析柱, 可用該方法。磁性無需樣品預處理(如離心或過濾)除去不溶物和微粒等物質，因此可以簡化純化過程。將磁性分離應用于高通量分析, 可以大大縮短純化過程(Saiyedetal.,2003)。

這需要將其小型化，并且可以進行多條件平行篩選，如篩選適合蛋白質表達的生長條件和純化用緩沖液。

順磁顆粒(paramagneticparticle)存在修飾和不修飾兩種形式。修飾通常采用親和配基 (如鏈霉素、GSH.proteinA等)，或者偶聯特異性識別的聚合物，如單克隆抗體和多克隆抗體(Konerackaetal.，2006)。除用于目標蛋白質純化, 也用于固定，繼而作為誘餌，從一個復雜的生物混合物中提取與其相互作用的分子。詳見第16章。

二、配基的選擇

選擇合適的配基，需要對配基和靶分子之間的天然相互作用有一定的認知及理解。

靶分子與配基的相互作用必須是特異性結合，并且在不同的結合和洗脫條件下均應該穩定。此外，制訂親和純化的方案時，需著重考慮能否購買到商品化配基，還是需要從頭研制配基和介質。后者的成功在很大程度上取決于對蛋白質結構和相互作用特性的已有認識，需要采用分子模建、化學合成和有機偶聯聯合以及對選擇性結合的分析。事實證明，設計一個新型配基、開發合適的偶聯化學作用和介質的時間和精力過于冗長和昂貴，因此這種情況下使用非親和純化技術可能是一個更好的選擇，如離子交換和疏水相互作用。

1.設計和選擇配基的一般注意事項

在開發一個新的親和純化材料時, 配基和靶分子之間的親和力是最重要的注意事項。

低親和力會降低結合效率, 導致回收率下降。親和力過高，苛刻的洗脫條件會導致目標蛋白質洗脫效率低或使其滅活，進而降低回收率。一般來說，親和常量為 IO6~IO8mol-1 時, 可用于親和純化。與目標蛋白質結合的親和配基，在與親和介質連接前最好先進行評估。要注意的是固定后配基的親和力可能與在溶液中的親和力不同，某些情況下，甚至可能改變特異性。

共價偶聯是將配基吸附于介質的首選方法，可以降低在純化過程中濾去配基的風險。

然而，在沒有活性基團存在的情況下也可以使用非共價吸附策略，或是用于降低配基變性的風險，如非特異性吸附、生物特異性的相互作用(生物素-鏈霉素）、包封(entrapment)及最近開發的分子印跡(Alexanderetal.,2006)。詳情請參閱本章第4節。

配基與靶標之間結合能力的降低，除親和力弱這一因素外，也可能是因為基質或其他配基導致的空間位阻引起的。配基和介質之間間隔物的介入能夠降低介質造成的空間位阻(Hageetal.，2006)。設計間隔臂(spacerarm)時，應該考慮其長度和疏水性兩方面，因為可以通過增強親水性而減少配基與靶標外其他分子的非特異性相互作用。間隔長度的優化也很重要，間隔太短也許不能緩解介質的空間位阻效應，間隔太長則可能會促進非特異性的相互作用, 或者可能會形成自身折疊從而限制特異性的相互作用。表面的配基密度也要進行優化。非常高的配基密度可能產生反作用, 造成結合能力喪失，原因可能是結合位點靠的太近形成空間位阻，或是強結合力限制洗脫效率(Hageetal」2006)o其他因素也可能影響最佳配基的選擇，如能否消毒、配基的穩定性、適當的儲存條件和價格等。

2.固定化配基的特征

親和樹脂是否具備在重復應用中保持性能相似的能力是判斷其實用性的—個重要因素。因此，確定最佳反應條件以保證性能一致顯得十分重要，包括優化合成所需的配基數量。確定合成中所需最佳配基量可以防止配基過多造成浪費, 進而降低成本。

對于共價連接，一般需要分析介質可連接的配基數量，并確定偶聯條件如何影響固定配基的數量。確定配基密度的一個簡單方法, 是分析反應后剩余的配基數量。偶聯完成后，用初始的配基總量減去剩余的配基數量。根據配基的性質，應采用不同的檢測方法，如分光光度法、BCA法(檢測蛋白質)、Ellman，s埃爾曼試劑（檢測巰基）、熒光檢測或其他檢測方法（Guilbault,1988;Langone,1982)。

某些情況下，如通過氨基酸分析或元素分析, 可以直接檢測載體上的配基，但是這會破壞材料，因此只適合少量檢測。結合能力評估可以間接評價固定化配基, 使親和介質處于純化所需條件下，評估保留在介質上的靶分子數量。這種方法與親和介質的性能直接相關，因此可能是固定化配基最有意義的檢測形式。最大載量需在平衡狀態下評價，通常以緩慢的流速或以直接混合的結合模式進行。注意：由于動態結合受到流速、介質孔隙內質量轉移以及親和常量的影響，因此動態結合能力可能與最佳結合能力不同。

3.運載特定配基的親和介質

近年來，我們見證了針對不同靶分子的親和配基以及商品化特異性介質的迅猛發展。

常用商品化配基的概述見表 26.2, 但并未涵蓋所有可購買的配基。現有大多數可購買的親和介質連接的配基通常稱為「組特異性配基」(groupspecificligand), 表現為對一組結構或功能相似的蛋白質形成親和連接，可以用于純化具有類似功能的不同目標蛋白質。在下面的章節中，我們描述一些親和介質常用配基。

4.免疫球蛋白結合蛋白質

免疫球蛋白的恒定區(Fe)與ProteinA 或 ProteinG之間可以結合，以此為基礎的抗體純化是親和純化中最有效并且常用的方法之一。ProteinA來源于金黃色葡萄球菌，ProteinG來源于鏈球菌。兩者均為細菌相關蛋白，可以與IgG類抗體結合—-這些抗體可以為不同亞型, 也可以來源于不同有機體。目前有很多關于 ProteinA和ProteinG親和力差異的詳細說明，如供應商提供的商品化產品說明（Gussetal.，1986;Hageetal.，2006)。此外，最近ProteinB和ProteinL 作為免疫球蛋白結合蛋白應用廣泛。proteinB是一類A鏈球菌的表面蛋白，可以結合某些人IgA型抗體，ProteinL[馬格努斯消化鏈球菌(Pe辦OSZr印tococcwsmagmfs)]能夠與kappa輕鏈相互作用, 且不影響抗體的抗原結合位點（Faulmannetal.，1991;Hermanson，1992)。因此ProteinL成為唯一的適合純化缺乏Fc區抗體的蛋白質。

大多數情況下，在中性或接近中性 pH 的條件下抗體結合能力較好, 但不同樣品的最適pH并不相同，這取決于具體使用的蛋白質。ProteinA在pH8.2時結合抗體的能力最強，ProteinL為pH5,ProteinG為pH7.5，但ProteinG也可以在pH7~7_5時使用。樣品洗脫常為酸性 pH(2.5~3.0)環境, 為避免樣品在低pH洗脫過程中變性或喪失生物活性，將其收集在中性或弱堿性緩沖液中。為防止低pH洗脫造成生物穩定性喪失, 需要探索鹽梯度與pH梯度結合的洗脫方式。

5.凝集素

凝集素是一組多樣化蛋白質，可以結合碳水化合物，具有高度的特異性。每一種凝集素都具有自己特異的使用方案。常用于從復雜的糖復合物中親和純化或濃縮碳水化合物基團，如多糖、糖脂和糖蛋白。還可以根據糖基化的特點，特異性分離不同的糖結構模式 (glycolform)。現在，凝集素不僅應用于純化含糖分子，也可以用于質譜分析時濃縮糖蛋白亞類(Hirabayashi，2008)。詳見第34章。

目前有超過1 00種的商品化凝集素，包括結合形式和單體形式，其中大部分是植物來源。來源于直生刀豆(CanawZiaensi/onm’s)的凝集素，即刀豆球蛋白A(ConA)是最常用的凝集素(Hermanson，1992), 其可以與『1>甘露糖、萄糖和JV-乙酰葡糖胺親和結合。另外兩個廣泛使用的凝集素是麥胚凝集素(WGA) 和榴蓮凝素(jacalin)。WGA 結合唾液酸和含有的N-乙酰-1>氨基葡萄糖殘基的分子, 榴蓮凝素結合 D-半乳糖基團。

通常在中性 pH、含糖條件下，將凝集素偶聯到樹脂上，這可以保護糖結合位點。靶分子通常也需要在中性 pH 條件下與凝集素結合。需要注意的是，有些凝集素需要二價金屬離子的存在，這樣更有利于靶分子結合，如 ConA 結合需要 Ca2+和 Mn2+。在洗脫緩沖液中加入過量的特異性糖分子進行洗脫，也可以進行梯度或分段洗脫。洗脫后，可通過透析或分子排阻的方法除去游離糖。

6.仿生配基

大部分的親和層析配基是天然存在的，其優點在于具有高度選擇性和強結合能力，但也存在某些缺點。這種配基穩定性低，需要進行純化，使用過程中批間差異大，易被其他生物分子污染，對滅菌方法敏感，并且成本高。為了克服這些局限性，加速親和層析在治療性蛋白質純化中的應用, 仿生型配基 (biomimetics)—合成親和配基或變構的親和配基已經成為研發重點，這是一種模仿天然生物配基結合方式和結構的物質。

活性紡織染料適用性強，呈現出多種競爭性生物分子具有的表面極性和空間構向性特征，可在水溶液中作為很多蛋白質的競爭性抑制劑、輔酶或效應分子，是應用最廣泛的仿生配基之一 (MadoeryandMinchiotti,2006;Stellwagen，1”0)。包括應用最廣泛的 CibacronBlueF3 G 染料在內，大多數仿生配基都含三嗉支架（triazinescaffold), 將其修飾后可以提高特異性，這也是仿生染料-配基概念的基礎。在過去的幾十年里，開發了充足的應用于蛋白質的廣譜的，也即非特異性的純化染料，包括針對血液蛋白（白蛋白）、還原酶、脫竣酶、糖酵解酶、核酸酶、水解酶、裂解酶、合成酶和轉移酶等，并且將染料作為配基的親和層析材料已經商品化 (表 26.2)(1^^0 11 抓~1 00 1^，1994;2002)。除了拓展商品化材料外，特制的仿生材料日顯優越并逐漸普及。通過模擬靶蛋白中的肽段、天然生物識別基序或暴露表面的互補殘基, 進而設計針對特異性靶蛋白的配基，這可通過設計合理的組合文庫再經合成、篩選進行制備 (Ceciliaetal.，2005;Labrou,2003;Loweetal.，2001)。通過親核取代反應在堿性條件下用載體表面的輕基取代染料中的氯，可以將含三嗪的染料固定在親和介質 (如瓊脂糖、葡聚糖和纖維素）上（Labrou，2000;LabrouandClonis，1994;Labrouetal.,1995)。

7.共價親和層析

通常親和層析是以靶分子與配基之間的可逆的相互作用為基礎，但也可以通過共價相互作用分離特殊的 IE 分子（BlumbergandStrominger,1972；GEHealthcare,2007；Hage,2006) o 靶分子中的巰基與純化介質上固定的活化巰基之間就是一種共價連接作用。可通過用 2-巰基乙醇、TCEP(乙基) 或二硫蘇糖醇還原半胱氨酸的二硫鍵，洗脫結合的蛋白質。

最近研發了另一種以共價結合為基礎的純化，即特異性的氯化烷烴配基（chloroalkane) 和 HaloTag 蛋白之間的共價相互作用，如圖 26.1 所示 (Losetal.，2008;Ohanaetal.，2009)。HaloTag 是一個 34kDa 單體蛋白融合標簽，可以根據需要通過基因技術與蛋白質 C 端或 N 端融合。HaloTag 蛋白由細菌鹵代掠經脫鹵素酶 (haloalkanedehydroIase) 演變而來，首先對其活性位點進行修飾，以形成具有特異氯化烷烴配基的永久共價鍵。接著再通過突變增加蛋白質的穩定性, 并達到類似于生物素-鏈霉素的結合速率。在此基礎上開發了一種基于 HaloTag 性質進行純化的層析介質，即帶有氯化烷烴配基的 HaloUnk 樹脂。該層析介質對 HaloTag 融合蛋白的共價捕獲結合速率快，克服了傳統親和純化中平衡相關的局限性，能夠實現對極低豐度靶蛋白的高效捕獲。此外，這種層析介質可以接受多種嚴格的洗脫條件，不會損失結合的蛋白質。雖然共價聯合有其優勢，但在洗脫目標蛋白質方面也面臨著挑戰。由于 HaloTag 和氯化配基之間的共價鍵不可逆，因此不能利用傳統方法從樹脂上洗脫蛋白質。但是，目標蛋白質可以由特定的蛋白酶 (TEV) 釋放, 其識別位點位于兩個基團（HaloTag 和融合靶蛋白）之間。一旦被酶切，HaloTag 融合的蛋白質就會被釋放，而 HaloTag 仍保持結合在樹脂上，形成髙純度的無標簽蛋白（Urhetal.，2008)。

根據 HaloTag 自身的特性，除了前面描述的利用 HaloTag 純化融合蛋白以外，還可以將 HaloTag 融合物固定作為親和配基。類似于 ProteinG，可以用于純化能與 Halo-Tag 融合蛋白特異性結合的抗體或其他蛋白質。該系統的優點在于，與其他共價固定技術不同，HaloTag 的固定化是通過活性位點進行單點吸附，因此可以定向。其他共價固定技術中蛋白質的結合是隨機的，可能會導致多個吸附位點和定位不正確。單點定向吸附能力可增加系統的有效性和再生能力，HaloTag 融合物與介質共價結合, 可以改進特異性抗體純化方法或 HaloTag 結合蛋白的分離方法。

三、化學吸附作用

一些傳統介質，如脂糖、纖維素、二氧化硅、玻璃及合成的高分子支持物，其表面與親和配基形成共價化學吸附，本節將簡要回顧其中較常見的吸附形式。從策略上分析，化學吸附作用可以分為 3 個部分:①介質表面或樹脂 (介質）；②連接組分或樹脂活性的成分 (間隔）;③親和配基。配基活性基團的類型和可用性限定了其如何與介質表面吸附。常見的基團是伯胺基、巰基和羧基。也可將配基修飾構建活性基團，如碳水化合物的氧化或正交活性基團的共價吸附，為配基的固定方式提供更多的選擇。合成小分子的吸附策略趨于遵循與生物大分子相同的化學途徑，但是在設計時往往也會有不同的考慮。

1.表面活化

制備共價親和介質表面首先從表面活化開始。介質表面以兩種方式接受配基，直接接受或通過活化連接物而接受配基，后者目的在于物理「隔離」配基與介質表面。表 26.3 總結了典型化學吸附，其中列出了已經構建的介質表面，并與用于吸附活化表面的配基主體進行對照。已經有多種已經商品化的預活化介質表面，所涉及的化學吸附類型多數可見表 26.3。如果配基表面已有合適的化學基團，那么其他要考慮的就可簡化為明確最優的反應環境，這要權衡偶聯反應發生的條件和影響配基穩定性的條件。大多數配基的偶聯反應在水溶液中進行, 控制緩沖液的 pH，反應時間為 1~20 h, 反應溫度介于 4°C 和室溫之間。由于反應的異質性，濃度和混勻程度對確保反應物均一分布是非常重要的。盡可能保持反應的液相體積不超過樹脂的 2 倍。配基濃度會因分子類型不同而變化, 但是對于蛋白質, 以 2.5~10 mg/mL 作為起始濃度是合適的。偶聯反應可有較寬的 pH 和緩沖范圍, 這取決于活化化學作用和配基活性（Hermanson，1992)。不同系統的表面活化效率各異，因此，封閉多余的表面反應基團以中和或降低非特異性反應是必要的。

2.配基吸附

對于多肽、蛋白質或核酸，通常采用的共價吸附是, 通過胺反應將配基上的氨基吸附在樹脂表面。溴化氰活化表面與伯胺發生反應形成亞胺碳酸鹽是最常見的胺反應吸附。

最典型的伯胺是賴氨酸側鏈（Hermanson,1992;PorathetaU1%7)(詳見第 28 章）。這種活化形式的優點在于可以使用商業化的預活化樹脂，與蛋白質的偶聯效率幾近 100%。

雖然過去一直普遍使用這種方法，但也存在許多缺點:①連接導致配基從樹脂上脫落;②配基直接吸附到介質表面, 無間隔;③由于溴化氰具有毒性，需要增加安全防范。而且，可能需要通過交聯限制這種固定方式存在的缺陷 (KorpelaandHinkkanen，1976;KowalandParsons，1980)。

酰胺鍵的共價吸附是一種替代溴化氰活化作用的方法，可以通過活化的羧基表面 (如羥基琥珀酯) 形成，或者用偶聯試劑對羧基進行原位活化，如沖乙基 N-(3-二甲氨基) 碳二亞胺 (EDCKWilcheketal.，1984;1994)。另一種可選擇的較穩定的方法是仲胺化連接。伯胺 (賴氨酸或 N 端) 和醛活化表面形成希夫堿 (Schiff 堿）中間體，后者經過還原烷基化形成仲胺。還原烷基化的吸附方法偶聯條件溫和，據報道與其他方法相比可以保留更多的酶活性，因此這種機制廣泛應用于將酶固定于碳水化合物表面 (瓊脂糖或纖維素）（Hermans o n，1992)~

胺反應連接也是小分子配基與介質表面吸附的常用方法。首要的是預先設計配基中用于吸附的胺基。很多可以用于胺固定的化學試劑也適用于硫氫基 (或硫醇基) 活化固定。在概念上, 巰基固定與胺基固定相同，但前者依賴于半胱氨酸與活性表面的反應。對于巰基特異性固定，兩個最突出的策略是通過鹵代乙烷 (碘或溴) 和馬來酰亞胺活化介質表面 (Malliketal.,2007)。巰基連接反應是可逆的，這也是其優點。用還原劑如 DTT 或 TCEP 處理, 可去除表面的二硫鍵連接 (Brniaetal.，1993)。

可以通過前面介紹的方法將抗體或糖蛋白固定到表面，也可以采用修飾碳水化合物的方式，這種方法可能更具有定向性（Oatesetal.，1998;VijayendranandLeckband，2001)。通過碳水化合物固定，需要采用溫和氧化物 (如髙碘酸鹽) 使碳水化合物的糖殘基發生成醛反應。氧化形成的醛用于將蛋白質或抗體固定至酰肼化表面。這種方法通常用于抗體、糖蛋白、糖聚合物和核糖核酸 (O’shannessyandWilchek,1 卯 0)。

在大多數情況下，采用前面討論的活性基團中的一種進行配基吸附就足夠了。但某些情況下，需要增加連接物與介質表面間隔的距離。一種方法是用間隔物對目的配基進行正交修飾，另一種活性集團會優先識別吸附在表面上的正交標簽。這需要用合適的活性基團修飾表面和配基。目前常見的所謂「點擊化學」(clickchemistry) 就是這種方法的具體體現，即銅 (I) 催化的疊氮末端炔烴化的 1，3 肩極環加成反應形成 1，2，3-三唑 (0^-dranetal.，2009;GauchetetaI.,2006)。這種方法的優點是，化學作用溫和，具有獨一無二的選擇性，并且活性基團可以在配基和介質表面之間隨意轉換。由于反應本身需要催化，因此與常用的硫醇和胺標記后活性基團相比，反應基團本身更加穩定。

四、純化方法

親和純化程序從適當處理樣品和介質開始，接著是靶標的選擇性結合 (捕獲)，清洗除去非特異性背景，最后洗脫結合靶標。親和純化的成功取決于一些值得注意的因素，包括樹脂上配基的數量和配基的可用程度、相互作用的強度以及固定蛋白質的完整性等。通常優化結合和清洗條件是為了將靶標及固定配基之間的反應最大化。然后從根本上轉換成減弱相互作用的條件, 釋放靶標。建議進行小規模實驗，以選擇最佳的純化條件。下面章節簡要概括一些常見的應用問題和影響親和純化的原因。

1.樣品制備

制備純化樣品時, 選擇的條件應能保持目的靶標適宜倍數和功能。強烈建議除去不溶物、降低黏度，因為這些因素都可能堵塞層析柱, 降低流速，增加反壓。

一些蛋白質在高濃度時有聚合傾向，導致表觀分子質量增加，降低擴散速率，減少親和介質的捕獲。此時，為了降低聚合, 增強對蛋白質的捕獲和回收能力, 需要將樣品或細胞裂解液稀釋至較大體積。但是，如果樣品太稀, 結合率和捕捉效率會降低，特別是對于低親和力的結合物。

2.結合和洗漆

結合效率與蛋白質-配基間相互作用的強度和動力學相關，受到相互作用的特性、應用靶標的濃度、固定配基量及結合流速影響。式 (26.1) 為結合過程的簡化，假設摩爾比為 I:1 時，Ka 為關聯平衡常數，[L] 為配基濃度，[T] 為靶蛋白濃度，[LT] 為復合物濃度。

Ka=[LT]/([L]X[T]), 也可以表示為九/々 dA 為二階聯合速率常數，取決于 L 和 T 兩者的濃度，&表示一階解離常數，不依賴于配基濃度。Ka 為總靶標與結合靶標的比值，Ka 越高，吸附率越高，結合效率越髙。通常情況下，介質上配基的濃度為 KT4~10_2m o l/L。

艮值為 IO4~IO6mol/L 時, 可以實現有效結合。

通常在環境壓力下，使樣品緩慢流過用親和介質裝填的層析柱，可將其親和固定至固相載體。一般來說，較高流速會降低結合效率, 特別是在配基與蛋白質間相互作用較弱或層析柱中的物質轉移速率很慢時。結合程序也可以以直接混合的形式進行，將樹脂和樣品持續混合。尤其在處理大體積樣品時，通常直接混合可以節省時間，有效地促進靶標和固定配基間的接觸。但是，直接混合也會增加非特異性結合。在純化過程中，優化樹脂用量是很好的解決方法。在結合過程中，多余的樹脂會增加非特異性結合，而且樹脂的再吸附性會降低 IE 標回收率，因此要優選使結合靶標達到飽和的樹脂用量。除非在某些特殊情況下才需要降低靶標回收率。

接下來的程序是洗滌。通過清洗去除非特異性結合的蛋白質。例如，通過增加鹽濃度 (0.1~0■5mol/L) 或改變 pH 降低離子相互作用; 通過降低鹽濃度, 改變 pH, 或加人表面活性劑 (如 TritonX-00) 去除疏水相互作用。也可用少量的競爭物去除與配基結合較弱的污染物。為了最大程度去除雜質，最小限度損失靶標, 應慎重決定清洗緩沖液的體積 (如 5~10 個柱體積) 和流速。

3.洗脫

實質上，從樹脂上洗脫結合靶標是結合的可逆過程。因此優化條件降低 Ka，即可削弱靶標和配基之間的相互作用。洗脫條件不應使靶蛋白質變性, 除非這些條件與下游程序兼容。

有兩種不同類型的洗脫方法，即特異性洗脫和非特異性洗脫。特異性洗脫過程中, 介質或競爭配基或競爭靶標，通過這種形式攻擊蛋白質-配基復合物，繼而將靶蛋白釋放至溶液中。用于洗脫的競爭介質的濃度和量 (體積) 依賴于其親和力，這種親和力與固定復合物的親和力相關。與親和力強的添加物相比，競爭介質的結合越弱越需要更高的濃度和更大的體積。對于弱的競爭介質，比配基高 10 倍是較好的濃度起點。特異性洗脫通常是溫和的，更可能保留蛋白質的活性。這種方法的缺點在于，洗脫慢，洗脫峰寬，需要從回收的蛋白質中去除競爭介質。對于非特異性洗脫，應控制溶劑條件降低關聯速率常量 [式 (26.1)]，該常量應趨近于零，同時增加解離速率常量，進而削弱整體親和力 (Ka), 導致復合物解離。根據配基與蛋白質之間的相互作用機制優化洗脫條件, 如增加鹽的濃度、降低離子相互作用或通過改變 pH 來改變質子化/離子化狀態，從而調節氫鍵強度、疏水相互作用及靜電相互作用。從固定的 ProteinA 或 ProteinG 上洗脫抗體就是一個改變 pH 的例子。然而 ProteinA/ProteinG 與抗體的親和力非常強 [Ka 為 lOVCmol/L)-1 左右)], 需要不同洗脫條件組合達到最大程度的抗體釋放。通常, 親和作用需要靶蛋白質正確地三維折疊，因此離液劑或影響蛋白質折疊的試劑可用于洗脫目標蛋白質，但是，必須注意保證耙標的正確折疊在洗脫后迅速恢復天然條件。當親和力弱時，高濃度靶分子結合后，通過稀釋以解離、洗脫復合物。這種方法即等度洗脫 (isocraticelution)。

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