親和層析的操作實驗

非特異性競爭 DNA 液氮 緩沖液 Z 緩沖液 Ze 柱再生緩沖液 柱保存緩沖液

EconoCoIumn 柱

材料與設備

EconoCoIumn 柱。（Bio Rad Laboratories731-1550)

非特異性競爭 DNA

液氮

試劑

緩沖液 Z

緩沖液 Z^e

柱再生緩沖液

柱保存緩沖液

(配方，見“試劑的配制”，PP.131~138)

操作程序

下述實驗是用緩沖液 Z 進行的，但用 TM 緩沖液也可得到好的結果。重要的是，應注意一些市售的 HEPES 和 PIPES 緩沖液中含有抑制蛋白質與 DNA 結合的混雜物, 因此，在某些方面，用 TM 緩沖液較為安全。有些轉錄因子如 SP1, 它們與 DNA 的親和性在無 Mg²⁺存在時高于有 Mg²⁺存在時。因此，在層析緩沖液中，可能不用 Mg2+更有利一些，例如，Z^e 緩沖液除不含 MgCl₂，其他與緩沖液 Z 完全相同。雖然，在這里所述的操作程序中，其層析緩沖液含有 KCl, 但 KCl 多半能用 NaCl 代替。對純化 AP-1 來說，可以用緩沖液 Z 也可以用 TM 緩沖液。
注：DNA 親和層析一般在 4°C 下進行。不過，也已觀察到有些序列特異性 DNA 結合因子結合 DNA(及 DNA 親和介質) 的親和性，室溫約 (22°C) 時高于 4°C。因此，對于每一種因子, 重要的是要確定它的最佳結合溫度。

1) 用 2X10 ml 緩沖液 Z+0.1mol/L KCl 平衡裝于 2-ml Bio-Rad Econo 柱的 DNA 親和介質（1 ml 柱床體積)。

2) 蛋白質組分（溶于 TM 緩沖液+0.1 ml/LKCl、緩沖液 Z+0.1mol/LKCl, 或緩沖液 Ze+0.1mol/LKCI 中) 與非特異性競爭 DNA 混合。
注：純化 AP-1 時，將 0.51 ml 經超聲處理的、濃度為 10A_260nm 的 poly(dI-dC) 與約 25 ml 從 12 升 HeLa 細胞制備的 S-300 柱峰洗脫物 (在 TM 緩沖液+1mol/LKCl 中) 混合，濃度為 10A_260nm 的 poly(dI-dC)≈850ug DNA/ml.

3) 蛋白質-DNA 混合物放置 10 min。

4) 混合物用 SS-34 轉頭，10000r/min 離心 10 min，沉淀不溶的蛋白質-DNA 復合物。將上清轉移至新管。

5) 依靠重力液流（15 ml/h/柱) 加載于層析柱。
注：從 12L 細胞純化 AP-1 時，一根 1-ml 柱應已夠用。純化大量原料時，則可平行使用多根 1-ml 柱，不過，通常在一根 1-ml 柱上可加載多達 50 ml 的蛋白質樣品。

6) 加載原材料后，用 4x2 ml 的緩沖液 Z(或 Ze)+0.1mol/L KCl 洗柱。
注：在本步中，徹底清洗親和柱是非常重要的。DNA 親和柱通常可使待分離因子獲得 100 倍以上的純化。不過，蛋白質純化 100 倍時，原材料中即使有 1% 的雜蛋白也會因親和層析柱清洗不徹底而成為親和層析純化的轉錄因子的主要雜質。

7) 用依次添加有 1-ml 含 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 和 0.9mol/L KCl 的緩沖液 Z,3Xlml 含1mol/LKCl 的緩沖液 Z 從柱上洗脫蛋白質。分部收集對應于所加的 1-ml 緩沖液部分的 1-ml 組分。
注：當純化新因子時，還應包括一步含 2mol/L NaCl 的鹽溶液洗脫。因為在少數例子中已發現，在1mol/L 鹽濃度下，序列特異性結合蛋白仍能與親和介質結合（在這些例子中, 這些因子要用 2mol/L 的鹽溶液來洗脫)。當用濃度大于 1mol/L 的鹽溶液洗脫時，因 NaCl 的溶解度高于 KCl, 故用 NaCl 比用 KCl 好。

8) 每個組分均留 2 份等分試樣（40ul 用于 SDS-PAGE 分析，25ul 用于 DNA 酶 I 足跡分析) 保存于 4°C, 各組分的其余部分液氮冷凍后，保存于-80°C。

9) 親和介質再生如下：室溫下，停止各親和柱的液流，然后給毎根柱加 5 ml 柱再生緩沖液。用細的硅化玻璃棒攪拌介質，使介質與柱再生緩沖液混合。讓緩沖液從柱下流出。再停止液流后，重復上述加緩沖液及其與介質混合的步驟。然后，用 2X15 ml 柱儲存緩沖液平衡，并將介質保存于 4°C。

10) 分析蛋白組分的序列特異性 DNA 結合活性 (對親和層析純化的 AP-1，其 8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染結果見圖 2-4)。如需進一步純化，可將含有活性的組分合并。然后（用不含 KC1 的緩沖液 Z) 稀釋合并的組分，或 (對緩沖液 Z+0.1mol/LKCl) 透析，至 KCl 終濃度為 0.1mol/L。將該蛋白組分與非持異性競爭 DNA(所需的種類和用量需由實驗確定混合，再用親和層析柱純化。