中國實驗動物信息網：人源化小鼠在腫瘤生長和癌癥免疫學等研究領域有哪些方面應用？
俞博士：在過去的50多年時間，研究者們通過將來自病人腫瘤移植到無胸腺裸鼠及SCID免疫缺陷小鼠的研究方法，已經成為驗證與評估人癌癥疾病治療效果方面非常有價值的工作。不幸的是，無胸腺裸鼠仍然保留了小鼠的先天免疫系統和B細胞，特別是保留能抑制腫瘤生長和轉移的小鼠NK細胞。而包括缺失NK細胞的免疫缺陷IL2rg小鼠的建立，則有利于成功移植各種人腫瘤，包括腫瘤細胞系，原位實體瘤及血液系統腫瘤等領域的研究及應用。
腫瘤病人來源的異種移植（PDX）至免疫缺陷IL2rg小鼠，可以實現保留原位腫瘤的異質性和基質效果。由于PDX小鼠中存在有人腫瘤侵潤免疫細胞，該模型成為腫瘤微環境中的非自發的異質性現象的貢獻之一。因此，免疫缺陷IL2rg小鼠為研究腫瘤與免疫系統相互作用提供了機會，研究者們可以通過移植人腫瘤細胞及免疫系統至免疫缺陷小鼠，探索腫瘤是如何與免疫系統相互作用，腫瘤免疫逃逸的機制，免疫調節潛在療法的機理。當然，PDX腫瘤經過再次傳代后，迅速損失原腫瘤基質，而被小鼠基質細胞所替代。
基于腫瘤細胞系在人源化小鼠模型而獲得的腫瘤及免疫系統相互作用的相關結果，由于其缺乏腫瘤異質性等因素，因而存在一定的應用局限性。而進一步改進的腫瘤模型如PDX腫瘤模型則有助于解決這方面的不足，因為原位移植的PDX腫瘤模型可以實現腫瘤組織的異質性與更加完整腫瘤微環境相結合的目的。
然而，如何獲得足夠量的自體同源的HSCs開展大批量的研究，則是構建人源化小鼠應用于PDX研究中一個潛在不利因素。最近，一種從臍帶血或G-CSF刺激并轉染tat-MYC和tat-Bcl2融合蛋白的PBL，分離獲得擴增的HSCs的方法，可以在體外擴增HSCs。如XactMice，
即將經體外擴增的HSCs移植的NSG小鼠，
再移植來自頭頸部體鱗狀細胞癌（HNSCC）病人的PDX樣品，腫瘤在此類小鼠中有人CD45陽性CD151陽性細胞，以及增加的淋巴血管密度，提示在小鼠的腫瘤微環境中人免疫細胞和基質細胞已經再生形成。
人源化小鼠應用T細胞編輯方面的研究也已成為現實。一種通過作用于免疫系統達到改善抗腫瘤免疫的機制，是通過導入TCR或嵌合抗原受體（CAR）基因改造T細胞方法，達到重新提升T細胞特異性的T細胞療法。CAR療法是基于構建針對特異性抗原T細胞受體，該抗原受非依賴于MHC限制，使得TCR被引導至選擇的任何靶點。雖然，T細胞再定位的療法已經用于臨床，人源化小鼠模型則可作為優化TCR/CAR調節的藥效及安全，以及擴大癌癥治療范圍等的評估方法。
將腫瘤特異性TCR通過轉基因（Tg)
方式導入T細胞的優化機制，已經在人源化小鼠模型進行了研究。關于Tg TCR療法的安全性考慮問題，是Tg
TCR與內源性TCR之間可能發生錯誤配對，引起脫靶特異性，從而增加了細胞毒性。有研究者利用ZFN方法將內源性TCRa和TCRb基因破壞后，表明在移植源WT-1陽性白血病的Hu-PBL-SCID模型中，編輯的Tg
T細胞具有只表達WT-1腫瘤特異性TCRs。
人源化小鼠也可作為免疫檢查點抑制劑的評價工具。利用檢查點抑制劑的作用機制作為腫瘤免疫調節療法，已經成為當前最具潛力的研究領域。
目前在臨床上成功研制的兩個免疫檢查點單克隆抗體，如抗細胞毒T淋巴細胞抗原4（CTLA-4）單抗，
該抗體具有阻斷抑制通路，激活T細胞的作用；和抗程序化細胞死亡-1（anti-PD-1)單抗，可以達到阻斷PD-1與其程序化細胞死亡-配體1（PD-L1）相互作用。這些阻斷作用在抵抗黑色素瘤方面都具有明顯效果，但不是所有的病人對CTLA-4和抗PD-1治療都有反應。因此，移植腫瘤的人源化小鼠被應用，可以成為更好地揭示阻斷與免疫系統之間的相互作用機制，以及測試與評價免疫調節劑效果與效率的工具。
最近的研究表明，應用人源化小鼠分析免疫調節抗體的藥物動力學，以及抗腫瘤的特性，如在人結直腸HT-29癌細胞和異源人PBMCs移植的Rag2
IL2rg小鼠中，或移植病人來源的胃癌組織及自體PBMCs的小鼠，利用抗hCD137和抗PD-1單抗聯合作用具有顯著降低腫瘤生長的效果。
中國實驗動物信息網：應用基因修飾方法建立人源化小鼠模型有哪些基本技術方法？賽業模式生物在這方面有什么優勢與貢獻？
俞博士：前面介紹的人源化小鼠模型多是基于免疫缺陷小鼠基礎上，通過移植人細胞和組織實現的。通過基因修飾的技術方法，將人相關基因直接替換小鼠相關基因，建立人源化小鼠模型的方式，也已廣泛應用于人基因功能研究、腫瘤免疫藥物研發、感染性疾病建立以及藥物臨床前評估與考核等生物醫藥領域研究。比如，通過對免疫檢查點相關的小鼠基因（如CTLA4和PD1等）進行人源化修飾，構建能與抗CTLA4和PD1人源化抗體相互作用的人源化小鼠，為這類抗體藥物的臨床前篩選與評估提供了有效的工具。通過對不感染小鼠，但感染人病原體感染分子機理的研究，探索建立可被這些病原體感染的人源化小鼠模型，為在小鼠體內研究其發病過程，建立有效疾病的防御與治療評價體系提供了可能性。如基于對引起中東呼吸道綜合癥（MERS)的冠狀病毒感染人細胞的分子機制研究的基礎上，利用基因打靶技術，將冠狀病毒感染結合人細胞DPP4基因替換小鼠的相應基因，構建了人源化DPP4敲入小鼠，研究表明，該人源化小鼠對冠狀病毒具有易感性，并可作為篩選評估MERS相應中和抗體效果的工具。
另外，近年來在人源化抗體制備的快速發展中，利用基因修飾的方法構建可制備人抗體的人源化小鼠，已經成為抗體藥物研發的重要研究領域。其中最為成功的例子為美國Regeneron制藥公司研發的VelocImmune小鼠。該人抗體人源化小鼠的制備策略是通過多輪基因打靶操作過程，分別用人抗體重鏈/輕鏈可變區替換小鼠同源區域獲得。該人源化小鼠在受到相應抗原刺激后，可生產針對特異性抗原的含人抗體可變區部分，以及小鼠抗體恒定區的人源化抗體。研究表明，與其他體外DNA重組方法獲得的人抗體比較，這類通過人源化小鼠篩選獲得人抗體具有更佳有效的親和力與活性。
目前，應用基因修飾的方式構建人源化小鼠模型的技術方法主要有以下幾種，1. 借助原核注射的方法，將人基因導入小鼠體內，達到表達人基因的目的；2. 利用小鼠ES細胞系，進行傳統基因打靶的方法，達到用人基因定點替換小鼠基因或插入人基因的目的；3. CRISPR/Cas9基因組編輯技術，通過原核注射方式，構建特殊目的的人源化小鼠模型；4.
Turobo
KO優化的ES打靶技術，該技術是賽業生物對傳統ES打靶技術進行優化，使其在構建人源化小鼠模型的研制中更加高效穩定。由于以上幾種技術方法都有其各自的優勢與不足，因此，在實際應用中，需要根據各自的研究需要與目的選擇更加適合方法。比如，雖然原核注射的轉基因構建方法本身方便，快速，成本低，但因DNA隨機插入的特性，可能對內源性基因干擾引起的風險，以及插入位置效應對基因表達的可能抑制影響，可能導致對以后研究帶來的不確定性因素。傳統基因打靶技術因其成熟性與穩定性，一直都是基因修飾小鼠制備的金標準，然而，由于該方法技術要求較高，操作步驟多而復雜，使其制備周期相對較長，也不利于其推廣應用。CRISPR/Cas9技術因其設計與操作相對簡單，對一般基因修飾的效率高，且沒有物種限制的特性，大大促進了其在人源化模式動物模型的研制。當然，因為存在脫靶效應，以及對復雜修飾效果難控制等風險也在一定程度上限制該技術等應用。在傳統ES打靶技術的基礎上，賽業生物經過多年的探索努力，推出的Turobo
KO基因打靶技術，包括建立生殖遺傳高效的TetraOne
ES細胞系，以及Neo抗性篩選基因自刪除系統等技術改進，不僅保留了傳統基因打靶技術的穩定性與成功率，而且提高其制備過程的有效性，使ES打靶技術的制備周期大大縮短。因此，賽業生物Turobo
KO基因打靶技術的建立，將更加有助于構建相對復雜的基因修飾人源化小鼠模型，為應用基因修飾技術制備不同類型的人源化小鼠模型提供了更多的選擇。目前，Turobo
KO基因打靶技術的建立也是賽業生物有別于其他同類供應商的明顯優勢之一。
中國實驗動物信息網：人源化小鼠模型的研究與應用未來需要解決的問題是什么？
俞博士：對建立在免疫缺陷小鼠基礎上的人源化小鼠模型需要從以下幾個方面進一步的改進與優化，1.
降低小鼠的先天免疫，使其達到更加有效的移植具有功能性的人細胞，組織和免疫系統，表達人分子，如能于供體人細胞相配的HLA等位基因，從而更加有利于人免疫發育和功能；2.
構建有助于免疫缺陷IL2rg小鼠的人相關淋巴結構（如含生發中心的淋巴結）發育，使人造血干細胞成為發揮完整功能性人免疫反應；3.
研究尋找與替換人免疫系統形成相關的特異性因素，因為這些因素可能是小鼠自身缺乏的，但卻是理想人細胞分化與功能需要的；4.
進一步評估與驗證PDX和PDX/免疫模型應用實際效果，使其實現能真實反映病人腫瘤微環境與免疫系統相互作用的機制，為探索新的有效腫瘤免疫治療方法與策略提供依據和基礎；5.
由于移植物抗宿主疾病在許多人免疫移植模型中都會發生，因此，建立降低或防止移植物抗宿主疾病發生的有效方法，為人源化小鼠模型作為有效的臨床前研究的工具，以及未來新藥開發與應用創造了條件。
而對于基因修飾人源化小鼠模型研制，如何篩選到合適有效的相關靶基因，對修飾靶基因自身的結構，剪切及表達特點的深入了解，基因修飾打靶策略的選擇，以及對目前不同基因修飾技術與方法的改進與優化等因素，都將是基因修飾人源化小鼠模型未來需要探索解決的問題。
總之，人源化小鼠模型等建立促使了人感染性疾病，癌癥，再生醫學，移植與宿主，過敏和免疫等領域的研究發展。利用人源化小鼠模型最終有可能實現臨床上真正“個性化” 醫療的目的。
中國實驗動物信息網：非常感謝俞博士接受中國實驗動物信息網的特邀專訪。
來源: 中國實驗動物信息網