人癌細胞染色體制備及觀察

一、實驗目的
學習人類染色體制備的常規方法，了解人癌細胞染色體及其變異。
二、實驗原理
目前大多數癌癥都建立了相應的細胞株或細胞系，體外培養的癌細胞多屬于連續的周期細胞，可以用來制備染色體。國內外制備動物和人類染色體的常規方法是空氣干燥法，該方法的關鍵包括：
1.秋水仙素的預處理：秋水仙素又叫秋水仙堿，它是從植物中提取的一種生物堿，秋水仙素對細胞的作用主要有兩個方面，一是阻撓微管的聚合、破壞紡錘體阻斷細胞有絲分裂，從而積累大量中期分裂相；二是使染色體收縮成一定的形狀。

2.低滲：用滲透壓很低的鹽溶液或蒸餾水處理活細胞，使細胞脹大而不破裂，使最后制成的片子染色體充分散開。
3.滴片、干燥：相對于過去制備染色體的切片法和壓片法的一種方法，首先制備細胞懸液，然后將懸液滴在載玻片上使細胞和染色體分散并緊貼在載玻片上，經自然風干或風機吹干，即可供染色檢查。
三、實驗器材、藥品
實驗材料：Hela細胞或白血病K562細胞。
器材：離心機、普通光學顯微鏡、10ml離心管、吸管、酒精燈、載玻片、吸水紙、擦鏡紙。
藥品：
（1）Carnoy固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1）
（2）0.1％秋水仙素溶液：取10mg秋水仙素，加入10ml0.65％生理鹽水。
（3）0.075M KCl
（4）Giemsa染液
Giemsa粉劑 0.5g
甘油 33ml
甲醇 33ml
先將少量甘油加入研缽中，將Giemsa粉充分研細，再倒入剩余甘油，并在56℃溫箱中保溫2小時，然后再加入甲醇混勻，儲存在棕色瓶內。
（5）pH 6.5的磷酸緩沖液。
四、實驗步驟
1.收集生長旺盛的細胞，吹打散，加入秋水仙素使終濃度達到1ug/ml進行預處理；
2.經預處理6－8小時后，以800rpm離心7min，去上清；
3.加入1ml 0.075M KCl溶液，輕輕吹打，使細胞重懸，然后補加7ml KCl溶液，室溫下低滲20min；
4.加入3－4滴Carnoy固定液后800rpm離心7min，去上清；
5.沿管壁慢慢加入3ml固定液，2min后用吸管輕輕的吹打，使細胞分散，固定10min后，離心去上清；
6.加新配的固定液3ml吹打均勻，固定10min，800rpm離心去上清；
7.重復第六步；
8.去上清后剩0.2－0.5ml固定液，用吸管吹打使其成為細胞懸液；
9.吸了細胞懸液滴于冰冷的載玻片上（經80％乙醇浸泡，0－4℃冰箱冷藏），吹散，過火5s左右；
10.風機吹干，置于裝有Giemsa染液的染色缸內，染色20min，水洗后吹干，鏡檢。