實驗方法原理 采用人肝惡性淋巴瘤術中新鮮組織塊分別植入裸小鼠肝實質內和肩胛間皮下, 觀察原位移植和皮下移植成瘤率, 移植瘤的侵襲、轉移；并進行形態學( 光鏡、電鏡、免疫組織化學) 、血清學[ 甲胎蛋白( AFP) 、乙型肝炎病毒表面抗原( H BsAg) 、乳酸脫氫酶( LDH) ] 檢測，染色體核型和流式細胞分析。
實驗材料 BALB C-nu nu 裸小鼠肝惡性淋巴瘤新鮮標本
試劑、試劑盒 RPMI-1640 培養液碘酊酒精在戊巴比妥鈉CD3抗體CD7抗體CD19抗體CD20抗體CD45RO抗體CD79a 抗體
儀器、耗材 絲線光學顯微鏡套管針手術刀紗布
實驗步驟
一、實驗動物準備
BALB/C-nu/ nu 裸小鼠，鼠齡4~ 6 周，體重17~ 20 g， 雌雄兼用，在無特定病原體( specific-pathogen free，SPF) 條件下本院裸鼠室內飼養。
二、標本來源
1. 肝惡性淋巴瘤新鮮標本來自1 例53 歲男性患者，術前實驗室檢查除LDH 升高( 1 200 U / L) 、HBsAg 陽性外，肝功能、AFP、CEA 和骨髓象均正常。
2. 手術證實為肝多發結節型淋巴瘤，肝臟右葉呈多發性瘤結節，左葉由多個瘤結節融合為5. 3 cm ×3. 5 cm × 3. 0cm 腫塊，切面灰白色魚肉狀， 結節中間部分黃白色，周邊有紅色不規則的充血帶。
3. 術中未見其他組織、器官侵犯或遠處淋巴結被累及，取肝左葉腫瘤結節病理診斷為肝臟非霍奇金B 細胞源性惡性淋巴瘤；慢性肝炎。
三、標本處理
無菌切取的人肝惡性淋巴瘤活體瘤組織， 置入RPMI-1640 培養液中， 清除非瘤組織， 將其剪切成1 mm ×1 mm ×1 mm 組織小塊，供移植用。
四、皮下移植
用2. 5% 碘酊和75% 酒精消毒裸鼠背部皮膚，用無菌套管針抽吸2 粒1 mm ×1 mm ×1 mm瘤組織塊， 行頸背部皮下組織移植。
五、原位移植
1. 裸鼠在戊巴比妥鈉( 30 mg/ kg ) 靜脈注射麻醉下， 取左上腹橫切口， 暴露肝臟， 切開肝左葉被膜， 將2 塊1 mm ×1 mm ×1 mm 瘤組織塊植入肝實質內，10-0 無損傷線縫合肝被膜，7-0 絲線縫合腹膜， 5-0 絲線縫皮。
2. 術后，繼續飼養， 逐日觀察腫瘤生長情況。
六、傳代
1. 當荷瘤裸鼠處于瀕死狀態時，取其中一只荷瘤裸鼠用頸椎脫位術處死， 系統解剖，取出移植瘤。
2. 取出的移植瘤一部分瘤組織以原代移植方法行鼠間連續傳代， 每次傳代裸鼠5~10 只不等； 另一部分瘤組織液氮凍存備用，并被用做相關指標檢測。
3. 其他荷瘤裸鼠飼養至瀕死狀態或自然死亡，以觀察其腫瘤的生長、侵襲和轉移。
七、 觀察項目
1. 解剖學和組織學檢查
（1）全部被處死和自然死亡的荷瘤裸鼠均經詳細解剖學檢查， 并記錄肝內腫瘤，皮下移植瘤生長情況。
（2）淋巴結取材包括：髂動脈旁、髂動脈間、縱隔、腸系膜、幽門、賁門和肝門淋巴結等； 肺、肝、脾、腎、腦等器官常規取材，所有組織均經10% 中性甲醛固定， 石蠟切片，蘇木精、伊紅( H E) 染色， 光鏡觀察。
2. 免疫組織化學染色
采用LSAB 法，對全部裸鼠肝腫瘤切片用CD3、CD7、CD19、CD20、CD45RO、CD79a 抗體進行免疫組織化學染
色，所用試劑均購自DaKo 公司。
3. 電鏡觀察
移植瘤組織以2. 5% 戊二醛和1% 鋨酸雙固定， Epon-812 包埋， 超薄切片，鈾- 鉛染色，PHILIPS-CM10透射電鏡觀察。
4. 實驗室檢查
AFP 放免法； 乙肝標志：HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb、HBcAgELISA 法； LDH-L 法。
5. 流式細胞分析
采用美國FACS-420型流式細胞儀， 對正常肝細胞、瘤源標本、移植瘤細胞進行DNA 含量測定。
6. 染色體檢查
采用短期培養，不加有絲分裂刺激方法，收獲細胞常規制片，GTG 法染色，顯微鏡下觀察。
7. 惡性淋巴瘤組織學分類標準
采用2001 年新的WHO 分類方法。
8. 統計學處理
差異顯著性采用t 檢驗, 數據以以x±s 表示，在SPSS10. 0 統計軟件上完成。
其他
MLL
占非霍奇金淋巴瘤的0. 016%，是一種少見的惡性腫瘤， 有關MLL 的病因學和發病機制至今尚未闡明，臨床上起病隱匿，
癥狀、體征和輔助檢查均缺乏特異性， 且與原發性肝癌或肝轉移腫瘤相混淆，診斷困難，術前確診率低，誤診率高，預后很差。因此， MLL
基礎和臨床研究都要求建立一個理想的、可供研究的人肝原發性惡性淋巴瘤裸鼠原位移植模型。經國際聯機檢索，有關人肝原發性惡性淋巴瘤裸鼠原位移植模型的建立在國內外迄今尚未見類似報道。本研究采用組織學完整的人肝惡性淋巴瘤新鮮組織塊原位移植于裸鼠，首次成功地建立了一株腫瘤完全局限于肝臟的人肝惡性淋巴瘤裸鼠原位移植模型HLBL-0102。對研究MLL
的生物學特性 、組織發生、 實驗治療、 腫瘤免疫、分子生物學都具有重要價值。在目前可供研究的MLL 組織標本不易獲得的情況下，
本模型的成功建立為系統開展MLL 的診斷、手術、放療、化療、靶向基因治療和藥物篩選等前瞻性實驗治療創造了有利條件。同時， 也為MLL
基礎理論的研究提供了同一人體來源，穩定傳代，容易重復的新鮮瘤組織標本和動物模型。
人肝原發性淋巴瘤原位移植裸鼠后， 能否始終保持原有的生物學特征是模型建成的關鍵。我們所建立的HLBL-0102 已傳至37 代，在裸鼠體內生長3 年，不僅移植瘤的組織病理學， 免疫組化表型，超微結構， DNA 倍體水平和染色體特點與來源MLL 細胞完全一致。而且腫瘤的移植生長率， 液氮凍存復蘇成活率均為100%。移植瘤無自發消退， 總是按照潛伏期， 緩慢生長期和快速生長期的規律進行增殖，宿主的生存時間比較接近死亡前總是呈惡液質狀態，這表明該模型的生物學特性是穩定的。
值得提出的是，移植瘤在宿主體內以類似于MLL 患者的方式展示其惡性行為。我們發現HLBL-0102 移植瘤完全局限于肝臟，肝呈多個結節腫大，切面散布著無數白色瘤結節，結節間有融合型實質瘤塊，結節間可見殘存的肝組織，嚴重時肝組織有瘤結節替代。無其他組織和器官侵犯及遠處淋巴結的累及， 完全符合MLL 診斷的標準。實驗中還發現HLBL-0102 完整的模擬了人MLL的體內表現：在MLL 患者體內發現的外周血AFP 陰性，HBsAg 及HBeAg 陽性，乳酸脫氫酶升高等均見于裸鼠原位移植瘤在裸鼠體內。而且LDH 水平隨著荷瘤裸鼠生長期的延長， 腫瘤增大而顯著增高。這說明了HLBL-0102 和HBLB-0103 這兩株模型雖然在裸鼠體內長期傳代仍保留人MLL 分泌LDH 的功能。HBsAg 檢測結果提示人肝惡性淋巴瘤在移植裸鼠后仍保持原來陽性特點。且作者觀察到瘤細胞彌漫地浸潤肝臟，破壞匯管區、膽小管及肝小葉結構破壞和瘤灶周邊匯管區可見大量成熟的淋巴細胞浸潤。本實驗也證實了Maher 等提出MLL 的組織發生起源于肝臟匯管區內的淋巴細胞和慢性肝炎病毒的持續刺激在MLL 的組織發生中起著重要作用。LDH 升高是診斷MLL 并判斷預后的敏感指標。這些結果表明HLBL-0102 完整的重現了MLL 臨床病理學特征及臨床生物學行為。
綜上所述， 所建立的人肝原發性惡性淋巴瘤裸鼠原位移植模型出現高的腫瘤移植生長率和肝內出現廣泛播散的原因為： ( 1) 腫瘤細胞本身的高侵襲惡性潛能； ( 2) 與移植部位微環境因素有關、如肝的特殊結構、豐富的淋巴、血液循環、生化及免疫學特點等。正是由于裸鼠肝微環境與人肝相似， 使植入的腫瘤出現類似于人肝原發性惡性淋巴瘤體內的播散過程，為肝原發性惡性淋巴瘤的基礎和臨床研究提供了理想的動物模型平臺。