人臍帶間充質干細胞的原代取材

實驗概要

人臍帶間充質干細胞的原代取材

主要試劑

含2% SP的DPBS、間充質干細胞培養液、10 mg/mL膠原酶Ⅰ、0.2% 膠原酶Ⅰ、10 mg/mL透明質酸酶

主要設備

眼科剪、眼科鑷、搖床、400目細胞篩、15 mL和50 mL離心管、3.5 cm培養皿

實驗材料

新生兒臍帶（獲得新生兒父母的知情同意）

實驗步驟

（1）將臍帶浸泡于含2% SP的DPBS中，在冰上運輸。
（2）將臍帶剪成2 cm左右的小段，用含2% SP的DPBS洗至無血液存在。
（3）剔除臍帶中的血管。
（4）將剔除血管后的臍帶用眼科剪剪碎成大約1 mm³細小組織塊；加入同等體積0.1 % 或 0.2 %（1 mg/mL 或 2 mg/mL）膠原酶Ⅰ消化液，轉移至15 mL或50 mL離心管中，再加入透明質酸酶至終濃度為0.2 mg/mL，37℃恒溫消化0.5~1 h。
（5）加入與酶液等體積的間充質干細胞培養液，終止消化。
（6）盡量將組織吹散，過400目細胞篩，室溫1000 r/min離心10 min。
（7）用間充質干細胞培養液重懸細胞，按每3.5 cm培養皿5×10⁵個細胞的密度接種標記為原代細胞（P₀）。
（8）置于37℃、5% CO₂、飽和濕度的培養箱中靜置培養。
（9）24 h后更換新鮮的間充質干細胞培養液，去除未貼壁細胞，以后每2～3天更換1次培養液。
 （10）待細胞長至80%～90%融合時傳代。