關鍵詞
生物分析，Oasis，樣品制備，肽定量，緩激肽，UPLC，CORTECS，血漿
簡介
緩激肽是一種含有9種氨基酸的生理和藥理活性肽，由蛋白質的激肽基團衍生而來（圖1）。激肽是可以促使血管舒張、血管通透性增強、一氧化氮釋放和花生四烯酸流動的效應因子。它是血壓、腎功能和心臟功能的重要調節因子，還參與炎癥反應1。緩激肽可引起血管擴張，從而導致血壓降低。因此，對這種激素肽的變化進行高靈敏度、高選擇性和高準確度地定量，并將其作為疾病進展或藥物治療的評估指標，將會極為有利。盡管以往都是通過配體結合試驗（LBAs）對生物制劑進行定量分析，但在過去幾年中利用LC-MS/MS分析大分子已成為一種趨勢。這在某種程度上是因為LBAs產生顯著的交叉反應問題并且缺乏標準化。LC-MS/MS具有多種優勢，例如開發時間更短、準確度和精度更高、可重復進樣，并且容易區分相似度很高的類似物、代謝物或內源性干擾物。常見的肽通常難以通過LC-MS/MS進行分析，這是因為其不易離子化以及不易產生理想的碎片離子而導致MS靈敏度較低，從而使得LC和樣品制備方法開發非常困難。由于緩激肽在血漿中的濃度低至pg/mL水平且代謝速度快，在采血和樣品制備過程中還可通過蛋白水解人為生成，因此對其進行準確定量相當困難。
本研究采用了專門設計的血液收集技術以防止體外緩激肽的形成，并且利用混合型固相萃取（SPE）和高效實心核顆粒色譜柱，最大限度降低并消除基質干擾的同時提高定量分析的靈敏度。
簡介
方法條件
系統：ACQUITY UPLC
色譜柱：CORTECS UPLC C18 1.6 μm，2.1×50mm
流動相A：0.1%甲酸水溶液
流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液
梯度：見表1
柱溫：35攝氏度
樣品溫度：15攝氏度
進樣體積：10 μL
總運行時間：3.5 min
收集板：Waters 1 mL ACQUITY收集板
MS條件
MS系統：Xevo TQ-S
電離模式：ESI+
毛細管電壓：3.0 kV
脫溶劑氣溫度：500攝氏度
錐孔氣流速：150 L/h
脫溶劑氣流速：1000 L/h
碰撞室壓力：3.58×10（-3）mbar
碰撞能量：按組分優化，見表2
錐孔電壓：按組分優化，見表2
數據管理
色譜軟件：UNIFI?1.6
定量軟件：UNIFI 1.6
數據管理
樣品預處理
將10 μL內標（IS）賴氨酸 -（脫-精氨酸9）- 緩激肽（10 ng/mL）加入200 μL人血漿中并混合。然后使用5% NH4OH水溶液對樣品進行1:1稀釋并混合。