樣品制備
將人血漿收集到含有EDTA和蛋白酶抑制劑的試管中，以防止體外形成緩激肽。使用Oasis
WCX（一種混合型吸附劑）進行SPE提取，提高提取的選擇性。此吸附劑依靠反相和離子交換保留機制將復雜血漿樣品中的緩激肽與其它高豐度多肽選擇性地分離開來。Oasis
μElution96孔提取板可在無需蒸發和復溶的條件下富集樣品。這不僅節省了時間，還減少了由于蒸發過程中收集板壁的吸附而導致的肽損失。預處理和清洗步驟的優化對于在樣品預處理和SPE提取中完全回收緩激肽至關重要。使用酸或堿對樣品進行預處理可降低粘度并增加與吸附劑的接觸時間，有利于抑制蛋白質結合，還可以通過離子交換功能使肽在SPE設備中得到更好的保留。在最初的方法開發中，通過用酸預處理血漿獲得了約80%的回收率。由于緩激肽是一種堿性的極性肽，其PI值為12.0，HPLC指數為47.8，因此懷疑它在最初的上樣步驟中發生了部分洗脫。當使用堿進行預處理時，回收率增加至約90%，這有利于在上樣步驟中通過離子交換改善緩激肽的初始保留性能。將清洗步驟2中的乙腈溶液由20%變為10%，消除了清洗過程中緩激肽的穿透現象，并使回收率提升至100%。在上樣前對血漿進行堿預處理的優化SPE方案與采用10%乙腈溶液的優化清洗步驟相結合，實現了緩激肽的完全回收，且基質效應小于10%。此外，由于UPLC分離在反相色譜進行，因此利用離子交換實現的肽分離為整個方法賦予了正交性。
線性、準確度和精度
為了生成標準曲線，用以下最終濃度的緩激肽對人血漿進行強化：5、20、30、60、100、200、400、600、1000、2000、6000和10000
pg/mL。在人血漿中制備以下濃度的質量控制（QC）樣品：25、80、250、800和5000 pg/mL。使用賴氨酸 -（脫-精氨酸9）-
緩激肽（最終濃度為0.5
ng/mL）作為緩激肽的內標（IS）。計算分析物峰面積與IS峰之間的峰面積比（PAR）。使用校準樣品的PAR并應用單一濃度（1/x）加權線性回歸模型構建人血漿樣品的校準曲線。然后根據校準曲線，通過PAR值計算出所有QC樣品的濃度。由于存在內源性緩激肽，因此采用標準品加入法。通過計算x軸截距確定對照血漿樣品中緩激肽的平均基底濃度。然后，將緩激肽的基底濃度加入到所有標曲濃度和QC濃度，以實現準確定量。使用1/x回歸，緩激肽所得曲線呈線性，R2值>0.99。表3所示為標準曲線性能匯總。QC分析結果示于表4中，內源性緩激肽和QC的典型色譜圖如圖5所示。所有濃度的QC樣品都表現出極好的準確度和精密度，滿足了有關LC-MS/MS檢測的生物分析方法驗證最佳實踐白皮書中建議的FDA可接受標準4,5。人血漿中緩激肽的平均內源性基底濃度測得為79 pg/mL，SD和CV%分別為4.4和5.5。以上數據證實了這是一種穩定且可重現的方法。
