從包含體中溶解大腸桿菌重組蛋白實驗

分子克隆技術能夠使細菌高水平表達蛋白，因此原核表達是一個非常便利的獲得重組蛋白的系統。遺憾的是這些蛋白在細菌中易于聚合和沉淀，形成難溶解的包含體，因而很難純化。非細菌蛋白的包含體尤其普遍。雖然沒有一種可用于所有蛋白的普適方法，還是有許多策略適用于包含體蛋白的溶解。本方案描述的就是這些策略之一。溶解包含體蛋白時要考慮許多步驟：

①細胞裂解；

②包含體的分離；

③洗滌包含體；

④溶解包含體；

⑤重組蛋白的復性（假如需要）。

表達目標重組蛋白的細菌細胞

復性緩沖液 溶解緩沖液 洗滌緩沖液

離心機

①如實驗方案6所述裂解細胞。

②4℃條件下23000g離心細胞裂解液30min。

③倒出上清，測定沉淀的濕重。

④用約10倍體積的洗滌緩沖液重懸沉淀，室溫攪動懸浮液1h。

⑤4℃條件下23000g離心混合物30min。

⑥除去上清，并重懸沉淀。

⑦重復④?⑥步驟3次以上（直到重組蛋白的純度>80%）。

⑧溶解步驟⑦的沉淀物，每克濕重沉淀（由步驟③決定）加入約8ml的溶解緩沖液，在4℃條件下溫和攪動混合物16?20min。

實驗提示：蛋白濃度不要超過2?3mg/ml其他的溶解緩沖液：

a.8mol/L鹽酸胍，10mmol/L DTT，50mmol/L Tris-Cl(pH8.5)

每12?15g濕重的收集細胞用15ml溶液溶解。37℃孵育混合物1h。如步驟⑨a.所述變性蛋白。

b.8mol/L脲素，2mmol/L還原型谷胱甘肽/0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽。

每克濕重包含體沉淀使用9倍體積的緩沖液。室溫孵育混合物1h。蛋白濃度不要超過2.5mg/ml。如步驟⑨,b.所述復性蛋白。

⑨特定目的蛋白的重新折疊所需的最適條件必須通過預實驗來選擇。復性條件包括：

a.用1.5μmol/L硫酸銅、50mmol/L Tris-Cl(pH8.5)溶液將可溶性沉淀稀釋25倍，至終濃度為0.04mol/L DTT、0.24mol/L鹽酸胍和約1.4μg/ml的目的蛋白。20℃孵育混合物2h。

b.緩慢將9倍體積的50mmol/L磷酸鹽、50mmol/L NaCl和1mmol/L EDTA(含2mmol/L還原型谷胱甘肽/0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽）加入溶解的沉淀中。25℃孵育混合物2?4h。

⑩用適合于目的蛋白的濃縮步驟來回收重折疊的蛋白（如RP-HPLC、凍干或超過濾)。

洗滌緩沖液：

100mmol/L Tris-Cl(pH8.0)

2?4.0mol/L脲

1%(體積分數）TritonX-100