實驗方法原理
分子克隆技術能夠使細菌高水平表達蛋白，因此原核表達是一個非常便利的獲得重組蛋白的系統。遺憾的是這些蛋白在細菌中易于聚合和沉淀，形成難溶解的包含體，因而很難純化。非細菌蛋白的包含體尤其普遍。雖然沒有一種可用于所有蛋白的普適方法，還是有許多策略適用于包含體蛋白的溶解。本方案描述的就是這些策略之一。溶解包含體蛋白時要考慮許多步驟：
①細胞裂解；
②包含體的分離；
③洗滌包含體；
④溶解包含體；
⑤重組蛋白的復性（假如需要）。
實驗材料 表達目標重組蛋白的細菌細胞
試劑、試劑盒 復性緩沖液溶解緩沖液洗滌緩沖液
儀器、耗材 離心機
實驗步驟
①如實驗方案6所述裂解細胞。
②4℃條件下23000g離心細胞裂解液30min。
③倒出上清，測定沉淀的濕重。
④用約10倍體積的洗滌緩沖液重懸沉淀，室溫攪動懸浮液1h。
⑤4℃條件下23000g離心混合物30min。
⑥除去上清，并重懸沉淀。
⑦重復④?⑥步驟3次以上（直到重組蛋白的純度>80%）。
⑧溶解步驟⑦的沉淀物，每克濕重沉淀（由步驟③決定）加入約8ml的溶解緩沖液，在4℃條件下溫和攪動混合物16?20min。
實驗提示：蛋白濃度不要超過2?3mg/ml其他的溶解緩沖液：
a.8mol/L鹽酸胍，10mmol/L DTT，50mmol/L Tris-Cl(pH8.5)
每12?15g濕重的收集細胞用15ml溶液溶解。37℃孵育混合物1h。如步驟⑨a.所述變性蛋白。
b.8mol/L脲素，2mmol/L還原型谷胱甘肽/0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽。
每克濕重包含體沉淀使用9倍體積的緩沖液。室溫孵育混合物1h。蛋白濃度不要超過2.5mg/ml。如步驟⑨,b.所述復性蛋白。
⑨特定目的蛋白的重新折疊所需的最適條件必須通過預實驗來選擇。復性條件包括：
a.用1.5μmol/L硫酸銅、50mmol/L Tris-Cl(pH8.5)溶液將可溶性沉淀稀釋25倍，至終濃度為0.04mol/L DTT、0.24mol/L鹽酸胍和約1.4μg/ml的目的蛋白。20℃孵育混合物2h。
b.緩慢將9倍體積的50mmol/L磷酸鹽、50mmol/L NaCl和1mmol/L EDTA(含2mmol/L還原型谷胱甘肽/0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽）加入溶解的沉淀中。25℃孵育混合物2?4h。
⑩用適合于目的蛋白的濃縮步驟來回收重折疊的蛋白（如RP-HPLC、凍干或超過濾)。
注意事項
洗滌緩沖液：
100mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
2?4.0mol/L脲
1%(體積分數）TritonX-100