核提取物的制備
核提取物制備優化
細胞質（S-100)組分的制備
| 實驗方法原理 | |
|---|---|
| 實驗材料 | 轉瓶或單層培養的哺乳動物細胞（如HeLa細胞） |
| 試劑、試劑盒 | PBS 低滲緩沖液 高鹽緩沖液 含1. 2 mol L KCl 透析緩沖液 液氮 |
| 儀器、耗材 | 貝克曼 JS4. 2 轉子或相當的轉子 50 mL 圓錐形刻度聚丙烯離心管（對較小體積的提取物也可用 15 mL 的離心管） Dounce 氏玻璃勻漿器（B 型研杵） Beckman JA-20 離心轉子或相當的轉子磁性攪拌器或傾斜臺 Beckman JA-20 離心轉子或相當的轉子磁性攪拌器或傾斜臺、 管型透析膜（14000 MWCO）、電導計 |
| 實驗步驟 |
1a) 收集轉瓶培養的細胞：將 5× 108?10× 108 細胞置 1 L 的塑料瓶 1850 g 離心 20 min。輕輕倒去上清并丟棄，將細胞轉入50 mL 錐形刻度離心管中（每管 2?3 L 培養液中的細胞）。進行步驟 2。 1b) 收集單層培養的細胞：單層細胞長滿后去掉培養液。用足量 PBS 洗 1 次，PBS 用 量為沒過細胞，輕輕振蕩，棄 PBS。將細胞刮入新鮮 PBS 液里，倒進錐形刻度離心管中。進行步驟 2。 2) 1850 g 離心 10 min。進行步驟 3a 轉瓶培養或步驟 3b 單層培養。 3a) 轉瓶培養細胞：輕輕倒出上清并棄掉。用離心管上的刻度測量壓緊后細胞的體積 (Pcv)將細胞重懸于約 5 倍于其 pcv 的 PBS 液中。1850 g 離心10 min。進行步 驟 4。 3b) 單層培養細胞：輕輕倒出上清并棄掉。用離心管上的刻度測量 pcv, 進行步驟 4。 4) 快速地將沉淀的細胞重懸于 5 倍體積的低滲緩沖液中1850 g 離心 10 min 并棄掉上 清。 5) 將細胞沉淀重懸于 3 倍于原 pcv 的低滲緩沖液中，放置在冰上 10 min，讓細胞腫脹。 6) 將細胞轉到 Dmmce 氏玻璃勻漿器中，用 B 號研杵上下抽提 10 次。用臺盼藍染色排斥法在顯微鏡下檢査細胞裂解情況（應大于80%?90%)。 7) 將細胞轉到離心管中。用 JS4.2 轉子 3300 g 離心 15 min 收集細胞核。保留上清用來制備 S-l00 細胞質提取物。 8) 用離心管上的刻度測量第 7 步離心壓緊后的細胞核體積（pnv)。用 l/2 pnv 體積的低鹽緩沖液重懸細胞核。 9) 在輕輕攪拌的同時，逐滴加入1/2 pnv 體積（見步驟 8) 的高鹽緩沖液。必要時用 Dounce 氏玻璃勻裝器混勻。 10) 不斷輕輕攪拌 30 min 以提取核內容物。 11) 用 Beckman JA-20 轉子 25 000 g 離心 30 min 以收集核提取物。倒出上清并測量其電導率（見步驟 12)，這就是核提取物。 12) 將核提取物加入透析管中，用夾子至少封住透析袋的一端；透析袋一端是打開的， 這樣就可以測量透析袋內核提取物的電導率，比較核提取物電導率和透析液電導率 的不同，以確定是否需要進一步透析。在 50 倍體積的透析液中進行透析，直到提 取物的電導率和透析液一致為止（即提取物的 KCr 濃度達到 100 mmol/L 時）。盡量縮短透析時間。 取 5?10 μl 提取物用水稀釋至 1 mL 用來測電導。用電導測量儀直接讀出稀釋液的電導值，與同樣稀釋的透析液的電導值相比較。 13) 將提取物從透析袋中移出，最后一次檢測其電導率以確定透析已經完成。將提取物25000 g 離心 20 min, 棄掉沉淀。 14) 測定上清中蛋白質濃度。根據需要分裝，浸入液氮中速凍，-80℃保存。
展開 |
| 注意事項 |
所有步驟的操作均在0?4℃進行，在冷室內操作更好。緩沖液和設備要預冷。所有離心均在4℃進行，轉子要預冷。 |
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