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  • 發布時間:2019-08-09 23:59 原文鏈接: 從大規模裂解物中制備λ噬菌體顆粒

    材料:
    緩沖液和溶液:
    氯仿
    NaCl(固體)
    聚乙二醇(PEG 8000)
    SM
    酶和緩沖液:
    胰Dnase I (1mg/ml)
    胰Dnase I (1mg/ml)于TE中(ph7.6)
    離心機和轉子:
    Sorvall  GSA 轉子或相當型號
    專用設備:
    量筒(2L)
    載體和菌株:
    大腸桿菌培養物,經λ噬菌體感染和裂解
    方法:
    用PEG沉淀噬菌體顆粒
    1、  將含有λ噬菌體的裂解培養物冷卻至室溫,加胰Dnase I和Dnase 至終濃度約為1ug/ml,室溫溫育30min。
    2、  每500ml培養物加入29.2固體NaCl(終濃度為1mon/L),攪拌使其溶解。將培養物冰浴1h。
    3、  4℃,11000g(8300r/min于Sorvall GSA轉子中)離心10min以去除細胞碎片,將四份培養物的上清混合置于2L的干凈量筒中。
    4、  測定所收集上清的總體積,然后轉移至2L的燒瓶中,加固體PEG至終濃度為10%(m/V,加500ml上清加50gPEG),于室溫用磁力攪拌器慢慢攪拌溶解PEG。
    5、  將噬菌體/PEG溶液轉移至聚丙烯離心管中,于冰水浴冷卻,至少放置1h以便使噬菌體顆粒發生沉淀。
    6、  4℃,11000g(8300r/min于Sorvall GSA轉子中)離心10min以回收沉淀的噬菌體,去上清,將離心管倒過來傾斜放置5min,以便是剩余液體充分流干。用移液器吸取殘余的液體。
    用氯仿抽提細菌碎片:
    7、  用一帶橡皮球的寬口吸干將噬菌體沉淀輕輕地重懸于SM中(針對步驟3每500ml上清加8ml SM),將離心管傾斜放置,使SM完全覆蓋并浸泡噬菌體沉淀,室溫放置1h。
    通過加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸浮液中的PEG和細胞碎片,溫和振蕩30s。4℃,3000g(4300r/min于Sorvall GSA轉子中)離心15min以分離有機相和親水相,回收含噬菌體顆粒的親水相。

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