從革蘭氏陰性菌中快速分離RNA

10 ml 革蘭氏陰性菌培養液  原生質體緩沖液 50 mg ml 溶菌酶  革蘭氏陰性菌裂解緩沖液   飽和 NaCl 溶液  DEPC 處理水   乙醇

一 材料與設備

1)10 ml 革蘭氏陰性菌培養液，

2) 原生質體緩沖液：15 mmol/LTris-Cl(pH8.0)，0.45mol/L 蔗糖，8mmol/LEDTA.

3)50 mg/ml 溶菌酶。

4) 革蘭氏陰性菌裂解緩沖液:10mmol/LTris-Cl(pH8.0)，10 mmol/LNaCl，lmmol/L 檸檬酸鈉，1.5%(m/V)SDS

5) 飽和 NaCl 溶液，

6)DEPC 處理水

7) 乙醇

二 操作方法

1) 于 4℃ 12000g 離心從而從 10 ml 革蘭氏陰性菌培養液中回收菌體，重懸于 10 ml 原生質體緩沖液，加入 50 mg/ml 溶菌酶，冰浴 15 min

2) 室溫或 4℃ 離心回收原生質體。重懸于 0.5 ml 革蘭氏陰性菌裂解緩沖液，加入 DEPC 水，混勻。移至微量離心管中，37°C 溫育 5 min，在冰浴巾冷卻。

3) 加入 250ul 飽和 NaCl，混勻，冰浴 10mim。

4) 于用微量離心機高速離心 15 min, 將上清移至兩個干凈微量離心管中，各加入lml 無水乙醇，在干冰中沉淀 30 min 或-20°C 過夜

5) 于 4℃ 用微量離心機高速離心 l5 min，用 500ul 冰冷 70% 乙醇沖洗沉淀，晾干。用 100ulDEPC 處理水溶解，取 10ul 稀釋于 lml 水中，測 A₂₆₀ 和 A₂₈₀ 以定量 RNA. 保存于-70℃