實驗概要
通過注射在體外用TAg致敏過的來自于DC細胞的外質體，在體內誘導了弓形蟲屬特異性Th1分子免疫應答并獲得了抗弓形蟲感染的保護效應。研究證實致敏的DC衍生外質體能夠對鼠弓形蟲感染和其它某些病原感染產生免疫保護。這種無細胞疫苗對于人類疫苗策略是一種很有吸引力的保護工具。
實驗材料
動物：8-10周齡雌性小鼠C57BL/6(H-2b)
寄生蟲：鼠弓形蟲RH株
實驗步驟
1. 弓形蟲抗原（TAgs）的準備
鼠弓形蟲速殖子洗滌，超聲處理后離心；用蛋白含量試劑盒測定離心產物，以牛血清白蛋白作為標準；等份相同超聲處理，做弓形蟲抗原，存于-20度。
2. TAg致敏或不致敏的DC2.4細胞的細胞表面標志
為了分析TAg的效力，200萬的DC2.4細胞懸浮于15ml介質中，加有L-谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素、5%熱滅火胎牛血清，過濾。培養于細頸瓶。這些DC細胞用50μg/ml TAg致敏18h.流式細胞計數法定量表面分子的表達；
在進行特殊染色之前，先用2.4G2抗體孵育10min來阻止在細胞計數時抗體結合FC受體。細胞用PBS洗兩次，然后與MAb在4度下孵育30min。在進行細胞計數分析前將細胞再用PBS洗兩次，然后懸浮于500μL的PBS。標記的細胞用流式細胞儀器分析。
3. DC2.4外質體的準備
差別超離心法分離DC2.4細胞系上清液中的外質體。
DC2.4細胞被洗后，分別重新培養于有或無TAg的新鮮介質中18h。上清液收集并離心300×g 10min除去細胞。上清液連續離心，4000 30min；10000 30min；100000 60min。產物在1ml PBS懸浮，然后離心 100000 60min。
產物懸浮于200μl PBS,然后用Micro-BCA kit測定蛋白含量。從上清液中大約獲得5μg的外質體。外質體制備的純化可用電鏡確認。
4. 外質體的電鏡檢查
外質體制劑用蒸餾水洗之前先存放于涂抹了碳的銅載網1min。格網用乙酸雙氧鈾溶液負染1min，充分干燥后電鏡觀察。
5. 外質體的尋靶
用50μg的DC2.4細胞衍生的外質體或500萬DC細胞與Cr51在37度下標記1h，然后洗去未參與標記的Cr51。50μg的DC2.4細胞衍生的外質體或500萬DC細胞被注射入受體小鼠的尾靜脈。小鼠在第2、6、24后死亡。收集血液和尿液，腸、肺、腎、肝、脾、腦、腘淋巴結被分離出并用3ml 1%的聚乙二醇辛基苯基醚相同處理。所有器官的放射現象用γ計數器計數。表達值以放射性與其他身體部位相比時的百分比。每組試驗用2只小鼠。
6. 外質體免疫和弓形蟲入侵
在所有試驗中，每間隔15天增加一批小鼠。靜脈注射相同劑量的10μg的經TAg致敏的和未致敏的DC2.4細胞衍生物外質體，25萬經TAg致敏的和未致敏的DC細胞，或10μg的TAg。對照組未經過處理。第二次免疫后10天口腔灌服30個或10個鼠弓形蟲76K株囊腫。
為了研究細胞免疫應答，在第二次免疫后第十天，在未感染鼠弓形蟲前收獲脾細胞。
為了研究體液免疫應答，在第二次免疫后第21天收集血清。
每天觀察攻擊30個囊腫的小鼠的死亡率。攻擊10個囊腫的小鼠，一個月后殺死取腦。每個腦分別加入5ml的PBS并研碎。在顯微鏡下計數每個腦勻漿的囊腫。結果不同的用標準差表達。
7. 免疫血清蛋白印跡
二次免疫后第21天從鼠眼球收集血清樣品，用于做免疫印跡。電泳和免疫印跡法純化鼠弓形蟲速殖子，作為抗原的來源。
8. 特異性抗原增殖反應的測量
二次免疫后第10天收獲的脾細胞用不銹鋼壓濾，然后再用血液尼龍過濾網過濾除去組織碎片，獲得單個細胞懸浮。用低滲休克法除去脾紅細胞。脾細胞懸浮于RPMI-1640，含有5%的FCS，25mM的HEPES,2mM的L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，5×10（-5）M的β-巰基乙醇，青霉素-鏈霉素，一式三份添加到平地的96孔微量滴定板中，每孔加200μl培養基或含有TAg的培養基，50萬脾細胞。10μg/ml的刀豆素A用于確定增生。平板在5%二氧化碳、37度條件下孵育3天，加入胸苷。再孵育18h后，用纖維玻璃過濾收集細胞，用液體閃爍計數檢測放射性。增生的表達作為刺激指數。
9. 細胞因子濃度的測定
脾細胞培養在24孔平板中，每孔加500萬細胞和1ml培養基或含有TAg的培養基。收獲無細胞的培養基上清液并分析IL-2 (at 24 h)，IL-4 (at 24 h)，IL-5 (at 48 h)，IL-10 (at 96 h)，and IFN-γ(at72 h) 活性。細胞因子濃聚物的測定用商品化的酶聯免疫吸附測定試劑盒，根據商家的說明，參照相應的已知的小鼠重組體IL-2，IL-4，IL-5，IL-10，和IFN-γ標準曲線。分析的檢測極限是50 pg/ml for IL-10，20 pg/ml for IFN-γand IL-5，10 pg/ml for IL-4和IL-2。
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toxoplasma gon
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