以酶聯免疫反應與堿性去磷酸酶呈色反應偵測雜合訊息
進行雜合反應時所使用的探針若為放射性物質所標定者，雜合訊息可經由放射顯影術 (autoradiography) 偵測出來；若為DIG所標定者，則需借助anti-DIG抗體與堿性去磷酸酶 (alkaline phosphatase, AP) 的conjugate，并利用堿性去磷酸酶的酵素活性轉現雜合反應訊息。 目前常用來進行堿性去磷酸酶呈色反應的基質為NBT (nitroblue tetrazolium) 與BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate,toluidinium salt)； 此外，也可以選用CSPD或CDP-Star等試劑，以增加檢測敏感度。
儀器用具：平端鑷子；旋轉搖蕩器 (rotary shaker)；
藥品試劑：DIG nucleic acid detection kit (Roche)，內含：Anti-DIG-AP conjugate
NBT/BCIP stock solution；Blocking reagent；Washing buffer (Maleic acid buffer + 3% Tween 20, v/v)；Maleic acid buffer (0.1 M maleic acid; 0.15 M NaCl; adjust to pH 7.5 with NaOH)；Blocking solution (1% blocking reagent in maleic acid buffer)；Detection buffer (0.1 M Tris-HCl, pH 9.5; 0.1 M NaCl; 50 mM MgCl2)；TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA)；Color-substrate solution (需要使用時取10 mL 的detection buffer，加入200 μL；NBT/BCIP stock solution 均勻混合)
方法步驟：
◆ 注意：
a. 以下反應條件與程序主要是參照DIG nucleic acid detection kit 制造廠商所提供的產品說明書。
b. 北方與南方雜合的尼龍膜可同步處理，所有反應于室溫進行。
c. 以平端鑷子將尼龍膜自一種溶液移至次一種溶液時，盡可能滴干前者的殘留部份，以免影響后續反應。
d. 浸洗過程應以搖蕩器低速搖動 (50 rpm)，以便加強作用。
1) 進行anti-DIG/AP conjugate 與DIG-核酸探針的免疫結合反應：
a) 以50 mL 的washing buffer 浸洗尼龍膜1 min。
b) Blocking：把尼龍膜放入20 mL blocking solution 作用30 min，以便填充尼龍膜上的非專一性結合部位。
c) 取出2 μL 的anti-DIG-AP conjugate，并以10 mL 的blocking solution 稀釋。
d) 免疫結合反應：把anti-DIG-AP conjugate 稀釋液連同尼龍膜一起放入塑料袋內，仔細除去氣泡并封口的后，低速搖動作用30 min。
e) 以50 mL washing buffer 浸洗尼龍膜2 次 (每次15 min)，以便去除多余及非專一性結合于尼龍膜的anti-DIG-AP conjugate。
f) 將尼龍膜放置于20 mL 的detection buffer 漂洗2 min。
2) 堿性去磷酸酶呈色反應：
a) 取出尼龍膜，放入10 mL 現配的color-substrate solution，并隨即把尼龍膜及作用溶液移至黑暗環境 (例如抽屜內) 作用。每幾分鐘檢視一次，待紫色條帶出現時即可終止反應。
b) 欲終止反應時，請把尼龍膜移至50 mL TE 浸漬5 min。
c) 拿出尼龍膜，滴干反應液后放置于衛生紙上風干至少30 min，加以護貝即可保存。