純化乳鐵蛋白的方法有許多種，許多公司選擇陽離子交換色譜系統來大范圍的獲得乳鐵蛋白。對于乳鐵蛋白的分離純化開始于上世紀80年代，許多公司都致力于開發獲得高純度乳鐵蛋白工藝。對乳鐵蛋白分離純化的方法從最初的陽離子交換到親和層析再到免疫學方法，以及各種方法的組合對于分離純化乳鐵蛋白都有個有利弊。
陽離子交換色譜。利用陽離子交換色譜從原料中分離獲得乳鐵蛋白是傳統的方法，其優點是操縱簡單、步驟少、持續進樣和容易擴大等優點。但是，傳統色譜層析用于快速的和大量的從乳清蛋白中回收乳鐵蛋白時表現出很多缺點，如色譜層析材料的污染、循環時間長、液滴通過色譜柱時壓力大以及復雜的控制系統，而且原料中許多與乳鐵蛋白帶有相同點和及相似等電點的雜蛋白在分離純化乳鐵蛋白時被一同洗脫下來，所以獲得的乳鐵蛋白純度低，費用昂貴和相對低的產量 。
膜吸附。由于乳鐵蛋白的熱穩定性差，而膜分離是一個不需加熱，沒有相變并且不需要化學試劑的分離過程。因此，該方法可以最大限度的保持乳鐵蛋白的生物活性，使之成為分離回收 乳鐵蛋白的一個優勢。Kerstin Plate 等研究是否能利用膜技術將乳清中乳鐵蛋白回收以及實驗室水平的設備是否可以直接應用于工業化。試驗用的膜面積從15cm2上升到4m2，其試驗結果表明，最佳條件是選用 Sartobind S 系統，膜面積擴大到2m2，8 個循環不用清洗。Almécija 等使用300 kDa 的陶瓷微孔膜從乳清中分離 Lf，研究表明，獲得乳鐵蛋白最佳的溶液 pH 值分別為5和10，前者可以獲得 乳鐵蛋白，而后者可以使乳鐵蛋白滯留在原乳清中。為了克服膜吸附無法區分近似分子量的弊端，Brisson 等使用荷電膜和電場的結合，電場使蛋白的移動起到了重要的作用，雖然解決了一部分純度問題，但是溶液表面發生的電解反應對于 Lf 的分離起到了負面的影響。
電分離。電分離技術是利用分子大小和其自身所帶電荷的不同對蛋白分子進行分離的技術，電流可以使得分離速度加快。與傳統壓力驅動方法相比，電場的應用的優勢在于提高了乳鐵蛋白分離的速度，但同時降低了其純度，原因是由于在分離 Lf 的同時其他乳清蛋白的遷移和蛋白間相互作用。電分離與微濾膜結合可以克服低選擇性和溶液污染等不足。N Ndiaye 等利用此方法對乳鐵蛋白進行了分離，乳鐵蛋白的最佳分離條件為 pH=3.0，以 2 g/L 的 KCl 溶液為溶液時，其最佳條件為 1.5×10-8m2/(V·s)；以去離子水為溶液時，其最佳條件為 3.0×10-8m2/(V·s)。結合 500 kDa的超濾膜，經過 4 h 的處理后，遷移率達到 46 %，產量為 15 %。該方法的不足是，在 pH=3.0 的時候，β-乳球蛋白也會一同被分離出來。